酶促选择性醇解制备n-3多不饱和脂肪酸甘油酯

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n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)具有多种有益生理功能。甘油酯、乙酯和游离脂肪酸是n-3 PUFA的三种存在形式,其中甘油酯型n-3 PUFA具有较好的生物利用度和稳定性,但是天然油脂中n-3 PUFA含量难以满足食品及药用要求。现有的酶法富集方法虽然具有选择性好,条件温和等优点,但仍存在富集效率低,n-3 PUFA含量达不到要求的问题。因此,本论文以天然鱼油和藻油为原料,探究酶促选择性醇解富集n-3 PUFA甘油酯的工艺条件,得到富含n-3 PUFA甘油酯的产品,并对醇解富集n-3 PUFA的机理进行研究,主要内容如下:首先,对六种含有n-3 PUFA的油脂(包括五种鱼油和一种藻油)进行分析,随后以1812鱼油为底物,在脂肪酶的催化下,鱼油中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)转化成脂肪酸或其甲酯,大部分n-3 PUFA则保留在甘油酯上。酶促醇解的工艺优化结果表明,来自Candida antarctica的脂肪酶A(CAL-A)对鱼油中的n-3 PUFA表现出强烈的歧视性;反应体系为甲醇(Me)水溶液,水分含量为47%(w/v),醇油摩尔比46:1,酶添加量为480 U/g油脂(w/w,8%),最适温度35℃,反应11 h后甘油酯中n-3 PUFA的含量从39.88%提高到71.41%,其中DHA和EPA的总含量提高至原来的1.81倍,且n-3 PUFA的得率为73.67%。上述研究结果表明,脂肪酶CAL-A催化的选择性醇解反应具有较高的富集效率。其次,对酶促醇解法富集n-3 PUFA甘油酯的底物适应性进行验证。以另外五种油脂为原料(包括2000鱼油、三文鱼油、凤尾鱼油、金枪鱼油和DHA藻油),在上述优化的反应条件下反应,并对纯化后产品进行分析。结果发现,甘油酯中n-3 PUFA含量均增加到原来的1.5倍及以上,其中以金枪鱼油和DHA藻油为原料时,产物中n-3 PUFA含量在60%以上。最终六种产品的甘油三酯(TAG)含量(50.04%~68.61%)、酸价(0.04~0.26 mg KOH/g)和p-茴香胺值(6.99~19.37)符合欧洲药典标准要求,过氧化值在5.12~7.34 mmol/kg之间。结果说明该方法的底物适应性较好,产品基本符合要求。最后,以1812鱼油为底物,分别考察鱼油和甲醇浓度对醇解反应初速度的影响,分别计算SFA,MUFA和n-3 PUFA从甘油酯上被醇解下来的最大反应速度(Vm)和甲醇对这三类脂肪酸的抑制常数(Ki M),以此研究脂肪酶CAL-A选择性富集n-3 PUFA的机理。结果发现,在上述最优反应条件下,醇解反应符合双底物乒乓Bi Bi机理,并受到甲醇的抑制,醇解初速度方程可表示为:(?)SFA的Vm为40.84 mmol/(L·min),MUFA的Vm为6.18 mmol/(L·min),n-3 PUFA的Vm仅为0.26 mmol/(L·min),甲醇对SFA和MUFA的Ki M(219.64 mmol/L和79.71mmol/L)远高于对n-3 PUFA的Ki M(0.30 mmol/L)。说明在最优的反应条件下,脂肪酶CAL-A对鱼油中n-3 PUFA的酯交换活性较低,甲醇反应体系抑制了n-3 PUFA从TAG上释放,增强了CAL-A的选择性。综上,以天然油脂为原料,通过酶促醇解反应制备出富含n-3 PUFA的甘油酯产品。醇解动力学研究表明,CAL-A在醇解反应体系中对TAG中SFA和MUFA具有较强的选择性,甲醇反应体系抑制了n-3 PUFA从TAG上释放,使得n-3 PUFA在甘油酯中得到富集。该方法选择性高,底物普适性好,富集效率高,最终产物符合药典标准,具有较好的应用前景。
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