目的:IgA血管炎（IgA vasculitis,IgAV）,又称过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura,HSP）,是一种多发于儿童的免疫球蛋白A介导的全身性小血管炎。该病的病程多呈自限性,但部分合并IgA血管炎肾损害（IgA vasculitis with nephritis,IgAVN）的患者可最终进展至终末期肾脏病。目前IgAVN的治疗方法主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂,但治疗效果欠佳且常伴有严重的副作用,对儿童的生长发育有显著影响。因此,探究IgAV的发病机制,寻找安全有效的靶向治疗方法是目前IgAVN研究的重点。多数学者认为遗传易感性、感染和免疫应答紊乱与该病的发生发展密切相关。IgAV相关的免疫异常主要体现为B细胞过度活化,导致以IgA为主的自身抗体大量产生。滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells,Tfh）可在生发中心（Germinal center,GC）中促进B细胞的生存、增殖、抗体亲和力成熟及抗体的同型转换,也支持GC中长寿浆细胞和记忆B细胞的形成,被认为是辅助B细胞产生免疫球蛋白促进炎症反应发生最重要的一类CD4+T细胞。Tfh细胞异常分化和增殖可导致自身免疫性疾病的发生。近来有学者报道,在IgAV急性期患者外周血中,Tfh细胞比例是增多的。Tfh细胞包含Tfh1,Tfh2,Tfh17 3种细胞亚型,不同的亚型促进不同的免疫球蛋白亚型的产生。其中,与IgAV发病密切相关的自身反应性IgA的产生主要与Tfh17亚型有关。因此,针对Tfh17细胞的靶向治疗可能会特异性抑制B细胞分泌IgA。因此,有必要对Tfh17细胞分化的机制进行深入了解。IL-6信号通路被证实对Tfh及Th17细胞的分化发育都至关重要,提示其可能促进Tfh17细胞的分化。托珠单抗是一种抗IL-6受体（IL-6R）的单克隆抗体,可通过抑制IL-6与跨膜和可溶性IL-6R的结合,阻断IL-6介导的信号,被证实在多种自身免疫性或炎症性疾病中均有良好疗效。在IgAV患者中,血清IL-6的浓度也是明显增高的。然而,托珠单抗对IgAV的治疗效果目前尚不明确。本研究的目的是探究Tfh17细胞的异常分化是否参与了IgAV的发病以及托珠单抗能否通过调节抑制Tfh17细胞的分化,减少IgA的产生,缓解疾病的发生发展,从而为IgAV的治疗提供新思路、新策略和新靶点。研究方法:第一部分:入组IgAV急性期患者及健康对照儿童（Health Controls,HC）各40例,采集外周血标本,分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,应用流式细胞仪检测Th1、Th2、Th17、Tfh细胞等CD4+T细胞各亚型的比例以及Tfh细胞亚型（Tfh1、Tfh2、Tfh17细胞）的比例,明确Tfh17细胞与疾病发病的关系。收集血清标本,应用Elisa方法检测血清中IL-6、IL-17A、IL-21的浓度,分析Tfh17细胞的比例与IL-6水平的相关性。收集患者临床资料及实验室结果等信息,分析Tfh17细胞、IL-6与疾病严重程度的相关性。第二部分:1.分离培养IgAV患者外周血PBMC,分别用IL-6和托珠单抗干预细胞72h,采用流式细胞仪检测患者PBMC中Tfh细胞、Tfh17细胞、浆细胞比例的变化。收集PBMC培养上清,应用Elisa方法检测IL-21的浓度。2.分离培养健康人CD4+T细胞,分别用IL-6、TGF-β、IL-6+TGF-β干预细胞96h,采用流式细胞仪检测Tfh细胞、Tfh17细胞比例以及Tfh细胞内信号传导及转录激活蛋白1（Signal transducer and activator of transcription,STAT3）及STAT3的磷酸化水平。3.分选并联合培养健康人树突状细胞和CD4+T细胞,用IL-6、抗TGF-β抗体干预细胞96h,采用流式细胞仪检测Tfh17细胞的比例,Elisa方法检测培养上清TGF-β的水平。第三部分:托珠单抗对IgAV大鼠发病的影响。选取5-6周龄雄性SD大鼠为实验对象。实验分为3组,分别为健康对照组、IgAV模型组、托珠单抗干预组,每组6只SD大鼠。隔日测大鼠体重,观察每组大鼠皮疹、尿便、进食、活动度的变化。IgAV大鼠发病后留取尿液,测量尿蛋白及尿肌酐,计算尿蛋白/肌酐比值。试剂盒检测血清尿素氮、肌酐值。Elisa法测量血清中IL-6、IgA、IL-17A水平。免疫荧光染色观察肾脏IgA沉积情况。HE组织切片染色观察皮肤、胃肠道组织血管炎性改变。HE及PAS组织切片染色观察肾脏组织中肾小球系膜增殖程度。观察脾脏大体外观,测量体重及脾脏重量,计算脾脏指数。免疫荧光及流式细胞仪检测脾脏中PNA的表达水平,流式细胞仪检测外周血及脾脏中CD4+T细胞各亚型（Th1、Th2、Th17、Tfh）、Tfh细胞各亚型（Tfh1、Tfh2、Tfh17）及浆细胞的比例,以及脾脏中GC-CD4+T细胞、GC-Tfh细胞、GC-B细胞的比例,同时用流式细胞仪检测Tfh细胞内STAT1及STAT3的磷酸化水平。实时荧光定量PCR技术检测Bcl6、Icos和Il17基因表达情况。研究结果:第一部分:1.与健康儿童相比,IgAV患者外周血Tfh细胞及活化的Tfh细胞明显增多;Tfh细胞亚型中,和Th17细胞仅轻微上升相比,Tfh17细胞亚型显著增多;与健康儿童相比,IgAV患者血清IL-17A、IL-21水平升高。2.IgAV患者外周血Tfh细胞的比例与B细胞比例呈明显正相关,Tfh17细胞比例与B细胞比例呈正相关趋势;IgAV患者外周血Tfh、Tfh17细胞的比例与血清中CRP水平呈正相关;与单纯皮肤型IgAV患者相比,合并多个器官累及患者外周血Tfh17细胞的比例更高,合并消化道出血的患者外周血Tfh17细胞的比例更高。3.与健康儿童相比,IgAV患者血清IL-6水平升高,IL-6浓度与CRP、ESR水平呈正相关,IL-6浓度与Tfh、Tfh17、B细胞比例呈明显正相关。第二部分:1.IL-6刺激可显著促进PBMC中CXCR5及Bcl-6的表达、Tfh17细胞及浆细胞的分化,培养上清中IL-21的浓度更高,而托珠单抗干预使上述Tfh细胞表型及Tfh17细胞、浆细胞的比例下降,培养上清IL-21水平也呈下降趋势。2.IL-6刺激可增强CD4+T细胞内STAT1及STAT3磷酸化水平,经托珠单抗干预后,Tfh细胞内STAT1及STAT3磷酸化水平下降;IL-6刺激可促进CD4+T细胞CXCR5及Bcl-6的表达,而经托珠单抗干预后,上述Tfh细胞表型下降至正常;在IL-6刺激下,Tfh17细胞的比例有轻微上升但未达统计学差异,而IL-6联合TGF-β可显著促进Tfh17细胞的分化,经托珠单抗干预后,Tfh17细胞的比例下降。3.IL-6可诱导树突状细胞分泌TGF-β,IL-6联合TGF-β促进CD4+T细胞中Tfh17细胞的分化。第三部分:1.托珠单抗对IgAV大鼠发病的影响:IgAV模型大鼠出现体重及活动度下降,饮食摄水减少,伴皮疹、血便、肾脏IgA沉积、尿蛋白增加等IgAV典型的临床表现;与健康对照组大鼠相比,IgAV模型大鼠血清IL-6水平升高;托珠单抗干预组大鼠皮疹减轻、肾脏IgA沉积及尿蛋白水平减少;IgAV模型大鼠皮肤及胃肠道组织HE染色提示血管充血、出血,炎性细胞浸润,肾脏组织HE染色及PAS提示肾脏系膜增生,托珠单抗干预组大鼠上述皮肤、胃肠道及肾脏病理改变均有减轻。2.托珠单抗对IgAV大鼠Tfh细胞及其亚型的影响:与健康对照组大鼠相比,IgAV模型大鼠脾脏及外周血Tfh细胞内STAT1、STAT3磷酸化水平明显增高,而托珠单抗干预可使其下降;IgAV模型大鼠脾脏及外周血Tfh细胞、Th17细胞的比例明显增多,Th1细胞、Th2细胞比例无明显差异;Tfh细胞亚型中,Tfh17亚型比例明显增多,Tfh1细胞、Tfh2细胞比例无明显差异;脾脏GC-CD4+T细胞（PNA+CD4+）、GC-Tfh细胞(PNA+CXCR5hiCD4+)的比例也是明显增多的;IgAV模型大鼠脾脏Bcl6、Icos和Il17基因表达增加,血清IL-17A水平升高。经托珠单抗干预后,上述细胞的比例、Bcl6、Icos和Il17基因表达及血清IL-17A水平均明显下降;3.托珠单抗对IgAV大鼠GC反应的影响:与健康对照组大鼠相比,IgAV模型大鼠脾脏及外周血浆细胞的比例、GC-B细胞的比例明显升高,血清IgA的水平也明显升高。托珠单抗干预后浆细胞、GC-B细胞比例、血清IgA的水平都明显下降;IgAV模型大鼠脾脏指数升高,脾脏PNA免疫荧光及流式细胞仪检测脾脏中PNA+细胞结果提示IgAV模型大鼠生发中心明显活化,托珠单抗干预可抑制GC活化。结论:1.Tfh17细胞参与了IgAV的发病。2.IL-6是诱导Tfh17细胞分化重要的细胞因子,并通过促进Tfh17细胞分化参与IgAV的发病。3.托珠单抗可通过抑制IL-6-STAT1、IL-6-STAT3信号通路抑制Tfh17细胞的分化,减少IgA的产生,缓解IgAV疾病的发生发展。