中国人结直肠癌中APC、P53、K-ras和PIK3CA基因突变的研究

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目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率都高居疾病排行榜的前五位。早期诊断是提高结直肠癌生存率的有效手段,但目前尚无便捷灵敏的诊断方法。基因改变的研究是结直肠癌诊断及治疗依据的研究方向之一。本文旨在应用PCR反应和DNA测序技术检测中国人结直肠癌中APC、P53、K-ras和PIK3CA基因的突变情况,分析它们分别与临床病理参数间的相关性,并研究这四个基因之间可能存在的相互关系,探讨其对于结直肠癌发生发展过程的影响。方法:本实验应用全基因组DNA的目的片段PCR扩增及DNA测序技术在79例结直肠癌患者手术切除标本中分别进行APC、P53、K-ras和PIK3CA基因的突变检测研究。①利用DNAPurification kit (Qiagen)提取基因组DNA,并用紫外分光光度计对DNA进行定量。②根据相关的经典文献,NCBI的基因库基因序列信息以及primer5引物设计软件针对相应基因进行引物设计。③利用相对应的引物摸索出恰当的条件后,分别进行APC、P53、K-ras和PIK3CA四个基因的PCR工作。④利用电泳鉴定PCR扩增获是否得了大小符合预期的特异性产物。⑤合格的产物送交测序公司进行Sanger测序。⑥对测序公司发回的结果进行分析,采用Chromas软件读取测序图谱和碱基序列,通过确认相应位点对应的氨基酸编码序列,最终确定每一标本基因点突变情况。⑦计算各基因的突变频率并分析其突变分布特点。⑧将各基因突变情况与临床病理参数(性别、年龄、淋巴结转移情况、病理分期和分级)相关性进行分析,并分析各基因突变间的相关性,以探讨这些基因突变对结直肠癌诊断或治疗所具有的临床意义。结果:实验结果显示,APC基因突变率25/79(31.6%),突变分布表现为区域密集,无典型的突变热点;P53基因突变率为25/79(31.6%),突变热点有密码子175(3/24),245(2/24),248(1/24),282(6/24); K-ras基因突变具有最高的频率,为30/79(38.0%),突变热点为位于外显子1上的密码子12,13; PIK3CA基因突变率为7/79(8.9%),突变热点为密码子542,545,546,1047。对APC、P53、K-ras和PIK3CA四组基因突变结果分别与临床病理参数的相关性进行统计分析,均未发现具有统计学意义的分析结果;将四组基因突变的阳性数据相互之间进行相关性分析,亦未发现其突变之间存在明显的相互关系。提示这四组基因突变分别对于结直肠癌的发生发展具有推动性作用。实验结果表明,在中国人结直肠癌中存在相当比例的APC、P53、K-ras和PIK3CA基因突变频率,且其四组突变病例之间并不具有明显的正负相关性。结论:①中国人结直肠癌中APC,P53,K-ras基因突变频率,APC基因突变率25/79(31.6%),P53基因突变率为25/79(31.6%),K-ras基因突变具有最高的频率,为30/79(38.0%),各基因突变热点或突变密集区域分布基本与西方人群报道相一致。②中国人群中结直肠癌中PIK3CA基因的突变频率较低,PIK3CA基因突变率为7/79(8.9%),中国人群与西方人群之间PIK3CA基因突变频率存在差异。③APC,P53,K-ras和PIK3CA四组基因的突变分别与患者年龄,性别,病理分期,淋巴结转移及肿瘤浸润深度等临床病理参数进行相关性分析,均未发现具有显著性意义的相关性结果。④四组突变病例之间的相互关联分析亦不具有明显的正负相关性,提示这APC,P53,K-ras和PIK3CA4个基因的突变分别对于结直肠癌的发生发展具有推动性作用,其中任何一基因变化都可以导致结直肠癌的发生和发展。
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