目的:应激是机体在遭受各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的非特异性全身反应,内质网作为细胞内环境稳态的重要组成部分,在受到外界刺激时会发生错误折叠蛋白或未折叠蛋白的蓄积,从而影响细胞的正常生理功能,形成内质网应激,而GRP78、ATF6、CHOP是发生内质网应激的标志性蛋白。下丘脑是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要组成部分,也是应激反应的重要调节中枢,而弓状核和室周核是下丘脑两个主要的多巴胺能神经核团,多巴胺神经系统在应激中发挥重要作用,因此探究应激反应中的下丘脑多巴胺神经核团的病理变化具有重要意义。本研究旨在观察不同时程应激对大鼠下丘脑弓状核和室周核神经细胞的影响、TH的表达变化以及多巴胺能神经细胞内质网应激蛋白的表达变化,为应激性损伤的机制研究提供病理形态学依据。方法:1本实验采用6周龄、体重为(200±20)g的SD雄性大鼠,将60只大鼠随机分组,组别为实验1天、3天、7天、14天、21天组及各相应时间点的正常对照组,每组大鼠6只。建立束缚固定加冰水游泳应激大鼠模型,将大鼠每日仰卧位束缚固定6小时(8:00-14:00)同时禁食水,束缚结束后进行5分钟冰水游泳。应激各组进行束缚及冰水游泳处理时,对照组大鼠于饲养笼中禁食水,其余时间各组大鼠自由进食、饮水。模型建立后,各实验组及相应对照组大鼠于次日处死,留取血清做ELISA检测,脑组织经固定、脱水、透明、包埋、连续切片等处理后留做各种染色使用。1)记录各组大鼠体重的变化。2)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent Assay,ELISA)检测血清中糖皮质激素浓度水平的变化。3)硫堇染色观察下丘脑弓状核和室周核神经细胞尼氏体变化及细胞形态学改变。4)免疫组织化学染色观察多巴胺能神经细胞阳性表达变化,同时采用全景组织细胞定量分析系统进行统计分析。5)免疫荧光多重染色观察多巴胺神经内TH与内质网应激相关蛋白共表达变化。2统计学分析:运用全景组织细胞定量分析系统的HistoQuest~?软件(TissueGnostics,Vienna,Austria)对TH阳性细胞数目进行计数统计。利用SPSS21.0统计软件进行数据统计,所有数据均采用“均数±标准差(Mean±SD)”表示,采用单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。结果:1.大鼠体重变化结果随实验时程的延长,对照组大鼠体重呈上升趋势。与正常对照组相比,实验1天组大鼠体重略有下降,随处理时间的延长,实验组大鼠体重也呈上升趋势,但增速小于各组相应正常对照组大鼠。2.血清糖皮质激素ELISA检测结果与正常对照组大鼠相比,实验组大鼠血清中糖皮质激素水平从第3天开始明显升高,7天组达到峰值,14天组依然维持在较高水平,21天时显著性降低,与正常对照组相比无明显差异。3.硫堇染色结果实验结果显示各时间点正常对照组无明显差异。分别在200倍和100倍显微镜下对各组下丘脑弓状核和室周核进行观察显示,正常对照组神经细胞尼氏体位于细胞质内,分布均匀,较丰富,实验1天、3天组尼氏体无明显变化,7天组部分神经细胞出现水肿、尼氏体结构不清,14天组部分细胞尼氏体消失、神经细胞固缩,21天组尼氏体消失及固缩的神经细胞数目增多。4.免疫组织化学染色结果(1)下丘脑弓状核内TH免疫组织化学观察与计数实验观察显示各时间点正常对照组无明显差异。使用HistoQuest软件(TissueGnostics,Vienna,Austria)在200倍显微镜下,分别对各组弓状核内TH阳性细胞数进行统计。与正常对照组相比,应激1天、3天组阳性细胞数目无明显差异;应激7天、14天和21天组阳性细胞数目减少,且随着应激时程的延长数目逐渐减少。(2)下丘脑室周核内TH免疫组织化学观察与计数实验观察显示各时间点正常对照组无明显差异。使用HistoQuest软件(TissueGnostics,Vienna,Austria)在100倍显微镜下,分别对各组室周核内TH阳性细胞数进行统计。与正常对照组阳性细胞数目相比,应激1天、3天组阳性细胞数目无明显差异;应激7天、14天和21天组阳性细胞数目明显减少,且随着应激时程的延长阳性细胞数目逐渐减少。5.免疫荧光多重染色结果(1)下丘脑弓状核免疫荧光染色共表达结果1)下丘脑弓状核TH与GRP78共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天组急剧升高,7天组共表达阳性细胞数目下降,随着应激时程的延长,阳性细胞数目逐渐减少,21天组与正常对照组相比无明显差异。2)下丘脑弓状核TH与ATF6共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天组开始升高,随着应激时程的延长,共表达阳性细胞数目逐渐升高,14天组达到峰值,21天时阳性细胞数目下降,与对照组相比无明显差异。3)下丘脑弓状核TH与CHOP共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天组明显升高,随着应激时间的延长在14天达到高峰,21天时略有下降,仍明显高于正常对照组。(2)下丘脑室周核免疫荧光染色共表达结果1)下丘脑室周核TH与GRP78共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天组急剧升高,7天组共表达阳性细胞数目下降,随着应激时程的延长,阳性细胞数目逐渐减少,14天、21天组与正常对照组相比无明显差异。2)下丘脑室周核TH与ATF6共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天时开始升高,且随着应激时程的延长在14天组达到峰值,在21天时阳性细胞数目下降,但仍明显高于正常对照组。3)下丘脑室周核TH与CHOP共表达结果与正常对照组相比,应激1天组共表达阳性细胞无明显差异,3天、7天组共表达阳性细胞数目有所上升,14天达到高峰,21天有所下降,但仍明显高于正常对照组。结论:本实验成功建立了大鼠束缚加冰水游泳应激模型,通过观察硫堇特殊染色、免疫组织化学、免疫荧光多重染色结果以及对数据的统计分析得出以下结论:较长时程的反复应激刺激可导致大鼠下丘脑弓状核和室周核神经细胞的损伤以及多巴胺能神经细胞的缺失,多巴胺神经细胞内内质网应激相关蛋白GRP78、ATF6、CHOP与TH共表达的变化提示内质网应激可能参与了下丘脑多巴胺能神经细胞的损伤。