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近年来,随着抗生素(含合成抗菌药)的大量使用及其在环境中的不断残留,细菌耐药问题已被联合国世界卫生组织评定为重大的全球卫生威胁之一。细菌耐药性的广泛传播源于耐药基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)的水平转移,此过程通过接合、转化和转导三种方式完成,其中通过接合和转化方式由质粒等介导的耐药水平传播已经有大量报道,但是通过噬菌体转导作用的方式却被广为忽视。有研究显示从人源相关环境样本中分离的噬菌体基因组中含有大量的耐药基因,表明噬菌体可能是耐药基因的重要存储库和传播载体;另一方面,鉴于养殖源环境与人类健康息息相关,深入了解养殖源环境(如我国猪源养殖环境)中噬菌体对ARGs的携带特性,并对其上下游基因环境分析ARGs通过转导方式传播的形成机制,对扼制ARG s通过转导机制进行水平传播有着重要的理论意义。本文以中国广东省内粤东(惠州)、粤西(茂名)和粤北(韶关)三个大型猪场为核心位点,分别提取母猪、公猪、肉猪和仔猪粪便样本中细菌及噬菌体宏基因组DNA,选用临床常见9大类32种不同ARGs,以研究细菌与噬菌体基因组DNA中ARGs的携带特性,并评估地理(Geographic)与时间(Temporal)因素对两种宏基因组DNA中ARGs传播能力的影响。结果显示,35.5%(11/32)ARGs在至少一个噬菌体宏基因组DNA中检测为阳性,其中基因sul1,blaTEM和ermB检测率为100%;对比各ARGs在两种宏基因组DNA中的丰度,基因ermB丰度在两者中均最高,而基因floR丰度则最低;为更好评估噬菌体携带并转导传播各ARGs的能力,使用噬菌体与细菌宏基因组DNA中ARGs的丰度比率值作为评估噬菌体转导ARGs传播能力的指标,其中qnrA的比率值最大,高于检测丰度最高的基因ermB,而基因fexA的比率值最小,低于检测丰度最低的基因floR同时地理与时间因素并没有影响各ARGs比率值的固层级结构,即qnrA>blaTEM~qnrS>sul1>ermB~floR>fexA,表明仅使用ARGs的检测率和检测丰度并不能全面预警和监控噬菌体传播各ARGs过程中的实际能力,三项指标的联合评估更具价值。为进行进一步分析,选取粤东(惠州)种猪场污水处理系统和池塘水系统为核心研究区域,利用宏基因组高通量测序方法解析猪源水环境系统噬菌体宏基因组DNA中所有已鉴定ARGs的生态分布和遗传背景,获得噬菌体携带ARGs的传播特性。结果显示,四环素类、大环内酯类和氨基糖胺类耐药基因丰度最高,其中黏菌素耐药基因mcr-1同样被检测为阳性;进一步依据耐药基因编码蛋白质的功能进行分类,噬菌体易于携带促进子超家族(Major facilitator superfamily,MFS)的基因(floR、mef(A)、mef(B)和 erm(F)),以及编码 ATP 结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白家族的基因(optrA、tet44、tetM、tetW、tetQ和tetO),且不依赖于地理位置和环境变化;污水处理进程中有氧过程促进了 tetW和tet44比率值的升高,同时降低了 β-内酰胺类耐药基因blaOXA-347的比率值,暗示促进和抑制过程,而兼性消化(兼具厌氧微生物和好氧微生物)的处理使其恢复至最初水平,表明污水处理系统并没有影响细菌及噬菌体宏基因组DNA对ARGs的携带及传播。相关研究表明,前噬菌体(prophage)作为宿主基因的一部分,其对ARGs的携带可能与其上下游基因环境密切相关,因此深入了解细菌基因组中前噬菌体的分布、多样性、ARGs的携带特性和ARGs侧翼序列基因环境将可以窥探转导传播耐药性的形成机制,提供对传播耐药性的新认识。本文以产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)为研究目标,从 132 株 ETEC 中共检测到1105个潜在的前噬菌体序列,前噬菌体序列大小的分布显示出三“峰”趋势,其中大小为14 kb占比最高,为6.73%;所有前噬菌体序列共携带32个ARGs,占比仅为2.65%(32/1206);对基因环境进行分析,前噬菌体中ARGs和侧翼序列一个或多个开放阅读框(Open reading frame,ORF)组成高度保守基因簇,分为两类:“blaTEM-1B”和“经典的1类整合子(Type Ⅰ integron,IntI1)”。对两类基因簇进行比对和注释,显示与转座子Tn3家族序列均高度相似但略有不同:“blaTEM-1B”类基因簇与经典Tn2转座子结构具有100%序列同一性,“IntI1”类基因簇与TnAs2转座子具有84%的序列同一性,结果表明噬菌体中ARGs可能与移动遗传元件(Mobile genetic element,MGEs)序列相连,促进其在细菌种群中广泛流行,更重要的是经典的IntI1结构和转座子序列共存于前噬菌体中,暗示噬菌体在传播ARGs的过程可能会以更快速和稳定的方式进行。从广义而言噬菌体转导进行ARGs的传播方式有两种,普遍性转导和特异性转导,其中由温和型噬菌体(前噬菌体形式)为主体介导的特异性转导过程虽最为普遍,但是由裂解型噬菌体为主体介导的普遍性转导过程仍不可忽视。本文以裂解型噬菌体为主体,特异性转导过程中transducing particle(本文均译为“误载噬菌体”)为节点,探究裂解型噬菌体通过普遍性转导方式对耐药基因blaCTx-M-65和floR传播的潜在影响。成功分离并鉴定一株T4-like裂解型噬菌体AH67C600Q9;在其对基因blaCTX-M-65和floR传播影响的研究发现同一噬菌体滴度和同一宿主菌浓度比例下,“误载噬菌体”对blaCTX-M-65和floR的携带频率差异显著,再次证明基因环境可能影响耐药基因的传播,然而利用噬菌体基因组深度测序并拼接成序列重叠群(contigs)以分析基因环境对blaCTX-M-65和floR传播的形成机制并非有效地手段。