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目的：初步了解中国非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacterium，NTM）的种类，为非结核分枝杆菌病的临床诊断、治疗和预防提供重要依据；评价聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP，PRA）和基因测序等方法在NTM鉴定中的作用。方法：1.2005年~2012年8年间收集来自中国8省（安徽、福建、甘肃、湖南、江西、内蒙古、四川和新疆）的省级结核病防治所/结核病院使用对硝基苯甲酸（PNB）/噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基的方法初步鉴定出的610株非结核分枝杆菌临床分离株，常规培养、保存。2.同时使用PNB/TCH鉴别培养和多位点PCR方法进一步进行分枝杆菌菌种鉴定。3.采用基于hsp65和rpoB基因的PRA方法将以确定的非结核分枝杆菌鉴定至种/亚种。对PRA方法不能鉴定出种/亚种者，采用多基因（包括rpoB、hsp65、ITS、gnd、glpK、secA和sodA）测序分析完成鉴定。结果：1.共收集到初步鉴定为NTM的临床分离菌株610株，经本研究使用PNB/TCH鉴别培养和多位点PCR方法鉴定为53株为结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB），其他557株可能为非结核分枝杆菌。2.使用PRA和测序方法对这557株进一步鉴定后，发现了4株为支气管戈登菌（Gordonia bronchialis），46株鼻疽诺卡菌（Nocardia farcinica）；和507株非结核分枝杆菌。其中非结核分枝杆菌共有28种，分别为：66株脓肿分枝杆菌（M. abscessus），106株鸟分枝杆菌（M. avium），17株龟分枝杆菌（M. chelonae），3株哥伦比亚分枝杆菌（M. colombiense），12株偶发分枝杆菌（M. fortuitum），1株日内瓦分枝杆菌（M. genavense），34株戈登分枝杆菌（M. gordonae），1株荷斯坦分枝杆菌（M. holsaticum），209株胞内分枝杆菌（M. intracellulare），3株堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii），2株熊本分枝杆菌（M. kumamotonense），6株缓黄分枝杆菌（M. lentiflavum），1株马提尼分枝杆菌（M. mantenii），5株马赛分枝杆菌（M. marseillense），24株马西利亚分枝杆菌（M. massiliense），1株摩纳哥分枝杆菌（M. monacense），2株新金黄分枝杆菌（M. neoaurum），3株副瘰疬分枝杆菌（M. parascrofulaceum），1株福西亚分枝杆菌（M. phocaicum），2株萨斯喀彻温分枝杆菌（M. saskatchewanense），1株塞内加尔分枝杆菌（M. senegalense），2株首尔分枝杆菌（M. seoulense），2株脓毒分枝杆菌（M. septicum），1株赛特分枝杆菌（M. setense），2株下出分枝杆菌（M. shimoidei），1株M. stomatepiae，3株苏尔加分枝杆菌（M. szulgai）和2株三重分枝杆菌（M. triplex）。3.507株非结核分枝杆菌中，按菌株数量统计，前9位分别为胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、马西利亚分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、缓黄分枝杆菌和马赛分枝杆菌。结论：1.共鉴定出28种非结核分枝杆菌，其中M. marseillense， M.saskatchewanense，M. seoulense，M. kumamotonense，M. stomatepiae，M. mantenii和Gordonia bronchialis6种为国内首次发现。证实在中国具有致病性的非结核分枝杆菌种类繁多。2. PRA-rpoB（内切酶MspI和HaeIII）和PRA-hsp65（内切酶BstPI和HaeIII）方法具有良好的分枝杆菌菌种鉴定效果。3.联合应多位点PCR、限制性片段长度多态性分析（PRA-hsp65和PRA-rpoB）和基因测序技术可有效的完成分枝杆菌菌种鉴定。