美达霉素(medermycin)是由链霉菌(Streptomyces sp AM-7161)产生的芳香聚酮抗生素，具有一定的抗菌抗肿瘤活性。美达霉素聚酮母核通过稀有的C-C糖苷键与脱氧糖胺相连。前期实验表明美达霉素生物合成基因簇中的基因med-ORF8是其生物合成必须基因，初步推断med-ORF8编码一个糖基转移酶(Med-ORF8)，负责C-糖苷键的形成，但目前对其结构以及酶学机制尚未阐明。本文利用生物信息学、基因定点突变和原核表达等方法对Med-ORF8进行初步研究，主要包括以下几方面的内容：　　 (1)Med-ORF8生物信息学分析　　 为了确定Med-ORF8中的突变位点，首先对其进行生物信息学分析：同源性分析认为其属于C-糖基转移酶家族，通过对Med-ORF8的氨基酸组成、相对分子量、理论等电点、亲疏水性等基本参数的分析，表明Med-ORF8的376个氨基酸中丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和缬氨酸含量最多，占到了总量的70.9％；理论等电点为5.84，不稳定系数为55.49，平均亲水性-0.076，说明Med-ORF8应属于不稳定的酸性疏水蛋白；在线分析Med-ORF8的二级结构，表明Med-ORF8共有11个β折叠、14个α螺旋。三级结构模拟分析表明Med-ORF8与UrdGT2(乌达霉素合成中的C-糖基转移酶)单体结构相似。　　 (2)大引物PCR定点突变方法的改进及Med-ORF8定点突变　　 利用ClustalW(http：//align.genome.jp/)在线对三种糖基转移酶(即C-、O-及N-糖基转移酶)氨基酸序列进行多序列比对，初步确定将Med-ORF8的I307突变为D307(天冬氨酸)。　　 为了对Med-ORF8进行点突变，首先对大引物PCR定点突变方法进行改进，主要包括：(1)用含有目的基因的质粒做模板，从长度上区别突变产物和原始模板；(2)避免在一个PCR反应中同时使用扩增全长基因的常规引物；(3)选择含不同抗性基因的不同载体克隆原始基因和突变基因，通过抗性选择筛选突变子，从而完全避免原始基因的干扰。实验结果证明利用改进后的方法进行基因点突变，可以减少操作步骤，提高突变频率。利用改进的大引物PCR法成功将美达霉素糖基转移酶Med-ORF8307位的异亮氨酸(I)突变为天冬氨酸(D)(获得的带突变点的med-ORF8命名为med-ORF8*)。　　 (3)med-ORF8*的原核表达体系的建立和优化　　 将点突变的糖基转移酶基因med-ORF8*插入原核表达载体pET-28a的NdeI和HindⅢ之间构建了原核表达质粒pHSL74-6，并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得原核表达工程菌株。优化原核表达条件，确定：med-ORF8*在大肠杆菌中大量表达，表达产物(Med-ORF8*)的分子量约43 KD。用0.05 mM IPTG或0.05％的乳糖在8℃条件下诱导20-24 h，Med-ORF8*形成包涵体的量减少，可溶性含量较高。　　 (4)点突变Med-ORF8*功能初步验证　　 将突变基因med-ORF8*克隆到链霉菌表达载体pWHM4*的XbaI和EcoRV之间构建了链霉菌表达质粒pHSL73-2，通过原生质体转化将pHSL73-2转化到med-ORF8基因缺失的基因簇异源表达系统中(即突变菌株天蓝色链霉菌CH999/pHSL3。质粒pHSL3含有美达霉素基因簇，但上面的med-ORF8被阿泊拉霉素抗性基因取代)。获得转化子在R4产素培养基上都能产生特征性色素(表明回补后还能产生一定的美达霉素)，是否有其它结构的产物出现还有待分析。　　 (5)美达霉素产生菌中与美达霉素合成相关化合物的分析　　 将美达霉素产生菌链霉菌AM-7161的发酵产物进行HPLC/MS分析，发现除美达霉素之外，还明显积累一个未知化合物X，且与美达霉素生物合成基因簇相关，可能为美达霉素合成中的旁路产物或中间体或次级组分。从质谱和全波长吸收图谱分析为含芳香结构的分子量为300的化合物。目前对这个X化合物的纯化条件进行了优化。