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目的:癫痫(epilepsy,EP)是一组不同病因引起的慢性脑部疾病,以大脑神经元过度放电所致的短暂中枢神经系统功能失常为特征,具有反复发作的倾向。癫痫的发病机制复杂,尚未完全阐明。很多癫痫患者除临床痫性症状发作外,常伴有学习记忆减退,成为影响患者生存质量的一个重要原因。有学者研究认为癫痫患者30%~40%存在认知功能障碍。a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-met-hyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受体是谷氨酸受体的一个亚型,AMPA受体是由GluR1~GluR4(或GluRA-GluRD)组成的异源型4聚体复合物,其中GluR1是AMPA受体的一个重要组成部分。近年来研究认为,GluR1与正常突触传递,突触可塑性以及空间学习记忆均密切相关。迄今为止,GluR1与癫痫后认知功能障碍关系的研究甚少。本试验利用戊四氮(pentylenetrazole,PTZ)诱导出慢性癫痫动物模型(chronicepileptic group,CEP),通过脑电图(electroencephalogram,EEG), Morris水迷宫试验(Morris water mazet)、交替电刺激Y迷宫试验(alternative electro-stimulus Y maze test,AESYT)、逆转录多聚酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫组织化学染色技术,观察GluRl在癫痫大鼠海马的表达变化,以探讨其与癫痫后大鼠认知功能改变的关系,为进一步研究癫痫患者记忆损害的机制提供线索。
方法:
1、造模
1.1 分组成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体重(200±20)g,经过两次交替电刺激Y迷宫试验筛选,合格者进行模型制备。筛选后获得合格动物48只,将实验动物随机分成两组:慢性癫痫发作组(CEP组)和对照组(NG组)。制模过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者,予以剔除并随机补充,以保证每组动物8只。
1.2 慢性癫痫动物模型的建立慢性癫痫发作组(CEP组)每日腹腔注射1%PTZ35mg/kg,直到大鼠连续3次注射期间均有RacineⅣ级或以上的痫性发作被认为完全点燃。对照组(NG组)同时腹腔注射同等容量的生理盐水。
2、脑电图
CEP组大鼠完全点燃后,每组随机取2~3只大鼠,麻醉后固定于脑立体定位仪上,放置双侧皮质和双侧海马电极,待大鼠清醒后,腹腔注射PTZ致大鼠有痫性发作,并描记脑电图,验证点燃效果。
3、认知功能检测造模成功后第31天,分组进行认知功能检测。分别进行交替电刺激Y迷宫试验和Morris水迷宫试验。
4、逆转录多聚酶链反应认知功能检测完毕后迅速分离海马。经提取海马总RNA、逆转录合成cDNA、引物扩增后,扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳,用UVP凝胶图像成像系统扫描定量并摄像电泳条带的灰度。凝胶图像分析系统分析结果。 5、免疫组织化学染色麻醉状态下经左心室行主动脉插管,4%多聚甲醛溶液进行灌注,取脑固定,常规包埋,标本冠状位石蜡切片。经抗原修复、羊血清封闭后,分别加GluR1多克隆抗体,再经二抗、三抗孵育,DAB显色后置显微镜下观察记录。
结果:
1、癫痫行为学各模型组大鼠均出现不同程度的痫性发作,造模成功。
2、脑电图改变CEP组大鼠阵发出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波。
NG组大鼠脑电图以a、β波,散在θ波即基础波为主,无明显节律。
3、认知功能检测3.1 Morris水迷宫试验3.1.1 定位航行试验(Place navigation test,PNT)CEP组与NG组相比,第1天无明显差异(P>0.05),第2天高于NG组,差异有显著性(P<0.05),第3天差异更为显著(P<0.01)。
3.1.2 空间探索试验(spatial probe test,SPT)CEP组大鼠120秒内穿越平台区域的次数明显低于NG组,差异有显著性(P<0.01),在平台象限的游泳时间两组无显著性差异(P>0.05)。
3.2交替电刺激Y迷宫试验CEP组与NG组比较大鼠的错误反应次数增多(P<0.05),但全天总反应时间,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 4、逆转录多聚酶链反应CEP组大鼠海马GluR1mRNA表达水平低于相应对照组,差异有显著性(P<0.05)。
5、免疫组织化学染色GluR1的免疫阳性产物在对照组及CEP组海马各区有弱阳性表达,两组相比,CEP组海马CA1、CA3区GluR1的免疫阳性产物减少,差异有显著性(P<0.05)。
结论:
1、本实验成功复制了戊四氮慢性点燃大鼠模型。
2、癫痫可以导致大鼠学习记忆功能障碍。
3、癫痫所致的学习记忆功能障碍可能与海马GluR1的表达减少有关。