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孕酮(Progesterone，P4)是一种性腺激素，它是反映卵巢活动的精确指示剂，所以监测机体孕酮含量变化是预防和治疗母畜繁殖障碍性疾病的一种有效的方法。我们检测孕酮含量，必须要有高效、灵敏和特异性的检测方法。本研究利用碳化二亚胺法制备孕酮完全抗原，用杂交瘤技术制备出孕酮单克隆抗体，建立了固相抗体ELISA检测方法，试验大体过程和试验结果如下：
首先选用孕酮衍生物——孕酮-11α-半琥珀酸酯(11α-hydroxyprogesteronehemisuccinate)作为半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)在偶联剂DCC碳二亚胺的作用下制备成免疫抗原(P4-BSA)和检测抗原(P4-OVA)。偶联后的抗原通过SDS--PAGE电泳鉴定证明偶联成功，可以进行动物免疫试验。
用免疫抗原免疫6～8周龄雄性Babl/c小鼠，免疫4次，每次间隔1个月，最后一次加强免疫后的第三天，无菌取脾脏，用融合剂聚已二醇(PEG)将脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT、HT培养液在96孔细胞培养板中37℃、5％CO2条件下选择培养，每2～3天半量换液，第11天换液时，对有细胞集落的培养孔，以P4-OVA包被酶标板，间接ELISA检测培养孔，如果检测孔为阳性孔，那么采用有限稀释法对其进行克隆，待其检测孔100％达到阳性时，停止克隆，最后获得两株稳定的抗孕酮的杂交瘤细胞株，分别命名为8G6、11A11。两株杂交瘤培养上清效价检测为1∶16000×、1∶8000×。腹水效价测定分别为1∶512000×、1∶216000×。8G6和11A11的免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG2a。两株杂交瘤细胞株特异性好，灵敏度高且8G6的亲和力优于11A11。
本实验以奶牛孕酮单抗克隆抗体8G6为基础，初步建立了孕酮酶免疫检测方法：检测抗原的包被浓度为2.18×10-5μg/ml，包被最佳时间为37℃作用2h，4℃过夜；最佳封闭液是5％羊血清，最佳封闭时间为37℃作用2h；8G6最佳工作浓度为1.39×10-4μg/ml；HRP羊抗鼠酶标二抗的工作浓度为0.001mg/mL(稀释度为1000×)；OPD/H2O2底物显色10min；2MH2SO4终止反应；酶标仪OD490nm读数；孕酮标准品最适检测范围为0.1～100ng/mL，为下一步孕酮检测试剂盒或生物传感器的研制奠定了基础。