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环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号途径参与了水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)毒性、胞外多糖产生、生物膜形成和运动性等表型的调控。不同类型的信号受体在信号识别、接受和传递过程中发挥了重要的作用。其中信号受体Filp可与Pil Z结构域蛋白PXO02715互作,共调控了病菌毒性及其相关基因的表达。然而,Filp/PXO02715是通过何种信号传递途径对毒性表达进行调控的机理尚不清楚。因此,本研究对Filp/PXO02715共调控元进行了功能鉴定分析,为阐明c-di-GMP信号途径及其毒性调控机理提供了科学依据。主要研究结果如下:1.Filp/PXO02715共调控蛋白的筛选和鉴定:采用iTRAQ方法,对野生型菌株PXO99A、单基因缺失突变体Δfilp和ΔPXO02715、双基因缺失突变体ΔfilpΔPXO02715进行了蛋白质组学定量分析。发现了108个受Filp和PXO02715共调控的蛋白质,它们涉及到多种细胞功能的调控。从中选取了10个蛋白质进行后续研究,包括PXO00476(HD-GYP结构域双组分系统应答蛋白)、PXO01515(Lux R/uhpA家族转录调控子)、PXO01585(PhoPQ调控蛋白)、PXO01644和PXO01883(TonB依赖型受体蛋白)、PXO03510(前噬菌体蛋白)、PXO04157(组氨酸激酶-应答调控子杂合蛋白)、PXO04752(趋化性蛋白)、PXO04753(EAL结构域应答调控子)和PXO05583(磷结合蛋白PstS)。2.Filp/PXO02715共调控蛋白表达模式的验证:分别制备了上述10个蛋白的多克隆抗体,提取了PXO99A、Δfilp、ΔPXO02715和ΔfilpΔPXO02715细胞全蛋白;以GAPDH作为内参,对10个蛋白的表达进行了Western Blot验证。结果表明,6个蛋白(PXO00476、PXO01515、PXO01883、PXO04752、PXO04753和PXO05583)在突变体(Δfilp、ΔPXO02715和ΔfilpΔPXO02715)中的表达量均比在PXO99A中的低;其他4个蛋白(PXO01585、PXO01644、PXO03510和PXO04157)在3个突变体中的表达量均比在PXO99A中的高。这些蛋白表达验证结果与iTRAQ分析结果相一致。3.Filp/PXO02715共调控蛋白基因转录分析:采用qRT-PCR方法,定量分析了上述10个蛋白编码基因在PXO99A及其突变体(Δfilp、ΔPXO02715和ΔfilpΔPXO02715)中的转录水平。结果表明,6个基因(PXO00476、PXO01515、PXO01883、PXO04752、PXO04753和PXO05583)在突变体(Δfilp、ΔPXO02715和ΔfilpΔPXO02715)中的转录本均比在PXO99A中的低;其他4个基因(PXO01585、PXO01644、PXO03510和PXO04157)在3个突变体中的转录本均比在PXO99A中的高。10个基因转录与蛋白表达趋势相一致。4.Filp/PXO02715共调控蛋白的功能分析:分别构建了上述10个基因用于缺失突变分析的自杀载体,成功获得了ΔPXO00476、ΔPXO04157和ΔPXO04752基因缺失突变体及其相应的互补菌株,测定了其致病性、运动性、胞外多糖(EPS)产生、生物膜形成、以及胞外纤维素酶和木聚糖酶活性等表型。结果表明,PXO00476和PXO04752正调控细菌毒性,而PXO04157负调控了毒性。与PXO99A相比,ΔPXO00476、ΔPXO04157和ΔPXO04752运动性增强;ΔPXO00476、ΔPXO04157和ΔPXO04752 EPS产生量增加;ΔPXO04157和ΔPXO04752生物膜形成能力增强,而ΔPXO00476生物膜形成能力减弱;ΔPXO00476、ΔPXO04157和ΔPXO04752胞外纤维素酶和木聚糖酶活性无明显变化。全长基因互补可使突变体表型恢复到与野生型相似的水平。另外,ΔPXO00476胞内c-di-GMP浓度明显比PXO99A的高,表明PXO00476可能具有磷酸二酯酶(PDE)活性,参与了c-di-GMP信号降解,从而调控了致病性、生物膜形成能力、运动性和EPS产生能力。总之,本研究鉴定了10个受Filp/PXO02715共调控的蛋白,验证了其在蛋白翻译和基因转录水平上的差异表达模式,阐述了其中3个蛋白在Xoo毒性调控中的功能,为解析信号受体Filp介导的c-di-GMP信号途径及其毒性调控机理提供了新见解。