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研究背景阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome,OSAS）是一种以睡眠时上呼吸道反复发生部分或完全塌陷为主要特征的常见疾病,其特点是慢性间歇性缺氧（Chronic intermittent hypoxia,CIH）。CIH类似于缺血再灌注损伤,为OSAS相关性心血管疾病的最重要的病理生理学机制,能引起心肌损伤及心功能不全。心力衰竭发生发展的细胞学基础是心肌细胞凋亡,而线粒体凋亡通路是细胞凋亡的主要途径。此外,线粒体功能紊乱也将产生大量的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,最终导致细胞凋亡。血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）作为血红素降解的限速酶,可催化血红素生成胆绿素、Fe2+和一氧化碳（carbon monoxide,CO）。HO-1与其催化产物具有抗炎症反应、抗氧化应激以及抑制凋亡的作用。同时,大量文献证实了HO-1对线粒体功能具有保护作用。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1,TRAP1）又称热休克蛋白75,主要存在于线粒体的内膜中,可维持线粒体呼吸链的完整性,通过减少ROS的产生,抑制氧化应激引起的心肌细胞死亡。我们前期研究显示:CIH引起的心肌功能损害与HO-1失衡有关,并证实诱导HO-1高表达对CIH引起的心肌损害具有保护效应;同时也发现,CIH引起的心肌细胞TRAP1蛋白表达与HO-1的表达趋势类似。因此我们推测HO-1通过TRAP1保护心肌细胞,减轻CIH引起心肌细胞损害起保护作用。目的观察不同间歇性缺氧（Intermittent hypoxia,IH）时间处理心肌细胞后线粒体各功能受损及细胞凋亡情况,探讨HO-1是否通过介导TRAP1抑制IH诱导的心肌细胞凋亡,从而减轻CIH引起的心肌细胞损害起保护作用。方法1.使用控制间歇性低氧的系统Bio-Spherix Oxy Cycler,培养AC16成人心肌细胞建立IH细胞模型;利用SD大鼠建立CIH动物模型。2.观察不同时间IH处理心肌细胞后线粒体各功能蛋白、细胞凋亡变化及HO-1、TRAP1表达情况:根据IH处理时间不同,将心肌细胞培养皿随机分为6组:常氧组（C组）、间歇低氧16循环组（IH16组）、间歇低氧32循环组（IH32组）、间歇低氧64循环组（IH64组）、间歇低氧96循环组（IH96组）及间歇低氧128循环组（IH128组）。应用免疫蛋白印迹（Western Blotting,WB）技术观察IH后心肌细胞线粒体融合蛋白-2（mitofusin-2,Mfn2）、分裂蛋白1（dynamin related protein 1,Drp1）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,Tfam）、线粒体呼吸链复合蛋白III（Complex III）、HO-1、TRAP1及凋亡相关蛋白caspase3,Bcl-2,Bax等蛋白水平的表达。3.观察CIH（8周）培养的SD大鼠心肌组织病理情况及HO-1、TRAP1表达水平:分离常氧组（Con组）及CIH组大鼠心脏组织,采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin,HE）染色左右心室横切面观察病理,使用WB技术、免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）染色技术观察HO-1、TRAP1表达情况。4.通过药物hemin（HO-1诱导剂）诱导或Znpp IX（HO-1抑制剂）抑制心肌细胞内HO-1蛋白表达,应用WB技术观察HO-1对心肌细胞TRAP1及凋亡蛋白caspase3蛋白的影响5.分别使用重组蛋白HO-1或TRAP1处理心肌细胞,观察TRAP1、HO-1及凋亡蛋白caspase3的影响。运用原位末端标记法（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测使用HO-1,TRAP1重组蛋白对IH心肌细胞凋亡的保护作用。结果第一部分1、构建慢性间歇性低氧SD大鼠模型,HE染色发现:常氧对照组（Con组）心肌组织细胞界限清晰,胞核居中相比;慢性间歇性低氧组（CIH组）大鼠心肌组织细胞间质界限较为不清,心肌纤维显著增宽,相对心肌细胞面积明显高于Con组（P＜0.001）。2、在CIH大鼠模型中,通过Western Blotting技术检测大鼠心肌细胞凋亡蛋白,我们发现:与Con组相比,CIH组Bcl-2/Bax比值下降（P＜0.01）,caspase3蛋白表达显著升高（P＜0.01）;TUNEL荧光实验示CIH组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。3、构建IH心肌细胞模型,通过Western Blotting技术我们发现:随IH循环次数逐渐递增,凋亡蛋白Bcl-2、caspase3表达水平逐渐升高（P均＜0.05）;抗凋亡蛋白Bcl-2则在IH后期显著下降（P＜0.05）;Bcl-2/Bax比值在IH后期明显低于C组（P＜0.05）。4、在IH心肌细胞模型中,通过Western Blotting技术测定心肌细胞线粒体动力学相关蛋白Drp1、Mfn2,我们发现:IH早期,Mfn2蛋白出现应激性升高（P＜0.05）,在IH后期表达水平则明显下降（P＜0.01）;Drp1蛋白在IH后期出现升高（P＜0.05）。IH后期,Mfn2/Drp1蛋白比例失衡,线粒体异常有丝分裂增加。5、进一步观察IH对心肌细胞线粒体功能的影响,通过Western Blotting技术,我们发现,在IH后期,心肌细胞线粒体Tfam蛋白表达水平明显低于C组（P＜0.01）,示心肌细胞线粒体基因转录功能障碍;Complex III蛋白表达水平明显低于C组（P＜0.05）,示氧化磷酸化功能出现障第二部分1、在CIH大鼠模型中,为观察CIH对SD大鼠HO-1、TRAP1蛋白的影响,Western Blotting测定CIH大鼠蛋白表达情况示:与Con组相比,CIH组HO-1、TRAP1表达均为下降（P均＜0.01）;免疫组化染色示CIH组心室心肌组织HO-1、TRAP1相对阳性面积比均显著低于Con组（P均＜0.001）。2、在IH心肌细胞模型中,为观察IH对心肌细胞HO-1、TRAP1蛋白的影响,通过Western Blotting测定蛋白表达情况示:HO-1、TRAP1蛋白两者表达水平趋势呈现一致性,在IH早期出现代偿表达水平升高（P均＜0.05）,IH后期因失代偿表达水平下降（P均＜0.01）。3、为验证HO-1与TRAP1的关系,使用hemin诱导心肌细胞HO-1高表达（P＜0.01）,Western Blotting观察TRAP1蛋白变化:IH后期（IH96组）HO-1表达上调使TRAP1表达升高（P＜0.01）。使用Zn PP IX抑制HO-1表达,结果示:IH早期（IH64组）TRAP1表达随HO-1水平下降而降低（P＜0.001）。4、为观察上述两种药物对心肌细胞凋亡的影响,通过Western Blotting技术,我们发现:hemin可抑制IH诱导下的caspase3蛋白升高（P＜0.01）;Zn PP IX则可导致C组及IH组caspase3蛋白升高（P均＜0.05）。5、为进一步验证HO-1与TRAP1的关系,使用HO-1重组蛋白处理心肌细胞,通过Western Blotting技术发现,HO-1重组蛋白可使IH组TRAP1表达升高（P＜0.001）;而使用TRAP1重组蛋白后,IH组HO-1表达水平无明显变化（P＞0.05）。6、为观察HO-1或TRAP1对心肌细胞凋亡的保护作用。通过Western Blotting技术检测,结果示:HO-1、TRAP1重组蛋白处理下,IH组凋亡蛋白caspase3明显降低（P均＜0.01）。运用TUNEL荧光技术,检测结果与WB结果一致,HO-1、TRAP1可明显降低心肌细胞凋亡率（P均＜0.01）。结论1、IH引起心功能不全的机制与心肌细胞线粒体功能障碍及心肌细胞凋亡有关2、HO-1/TRAP1信号通路是IH引起心功能不全重要的保护机制