研究背景和目的癌症是威胁人类健康的重大疾病之一,其发病率和死亡率逐年递增,其中肺癌和白血病位于癌症死亡率的前列。干扰肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管生成和(或)诱导肿瘤细胞死亡是治疗肿瘤的重要策略。凋亡是研究最多的一种细胞死亡方式,许多治疗肿瘤的药物可以启动内源性或外源性途径来诱导肿瘤细胞凋亡。另外,通过诱导其他非凋亡形式的细胞死亡,如自噬和坏死,也可以治疗肿瘤。自噬是真核细胞中一个高度保守的生物学过程,又称为Ⅱ型程序性细胞死亡,参与许多生理或病理发展过程,如肿瘤、感染及衰老等。因此,研究凋亡和自噬的调控机制可为肿瘤治疗提供有力的理论基础。转录因子Nrf2属于cap’n’collar碱性亮氨酸拉链蛋白成员,在各种组织细胞中广泛表达。在氧化应激条件下,Nrf2介导的信号通路作为一种防御机制,在肿瘤发生过程中的作用机制已被深入研究。组成型活化的Nrf2与多种癌症包括肺癌和急性髓性白血病(AML)的高发密切相关。目前已报道的Nrf2抑制剂有全反式维甲酸、维甲酸受体α激动剂、木犀草素及鸦胆子苦醇等,数量很少,由于其特异性、生物活性或毒性等因素限制了在临床上的应用。因此,发现或合成更多的Nrf2抑制剂对于提高肿瘤治疗效果是一种潜在的治疗策略。吡唑环是很多天然化合物的核心结构,其五元含氮杂环结构上有多个修饰位点,可以作为新型药物的先导结构。许多吡唑类化合物表现出广泛的生物活性,特别是抗肿瘤作用。羟肟酸衍生物具有抗氧化、消炎、杀菌以及抗肿瘤等作用,在临床上也有广泛应用。目前已有多种羟肟酸衍生物用于肿瘤临床治疗,如曲古抑菌素和新乙酰苯胺异羟肟酸等。但是,吡唑轻肟酸类化合物的抗肿瘤效果尚未摘清。因此,我们在先前工作的基础上,根据吡唑和羟肟酸结构合成了一系列新型吡唑羟肟酸衍生物,从中筛选出一种有效的Nrf2抑制剂——1-(4-(叔丁基)苄基)-3-(4-氯苯基)-N-轻基-1H吡唑-5-竣酰胺(4f),并研究了其对人急性白血病细胞(THP-1、HL-60和U937)和非小细胞肺癌细胞(A549)的生长抑制作用,证明了化合物4f通过诱导凋亡或自噬来抑制肿瘤生长的分子机制。因此,吡唑羟肟酸衍生物4f有望成为新型化疗药物的先导化合物,为肿瘤治疗提供新思路。研究内容1.鉴定抑制Nrf2活性的吡唑羟肟酸衍生物2.研究吡唑羟肟酸衍生物4f对人急性白血病细胞(THP-1、HL-60和U937)生长的抑制作用及其机制3.筛选能够抑制非小细胞肺癌A549细胞生长的吡唑羟肟酸衍生物并研究其生物活性4.研究吡唑羟肟酸衍生物4f调控A549细胞自噬的分子机制研究方法1.细胞培养人急性髓性白血病细胞(THP-1、HL-60和U937)、非小细胞肺癌细胞(A549)、稳定转染抗氧化应答元件(ARE)-荧光素酶报告基因的人宫颈癌细胞(HeLa)、稳定转染绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)的神经胶质瘤细胞(U87)、正常人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、小鼠胰岛内皮细胞(SV40T抗原永生化的MS1)均采用无特殊处理的正常培养条件进行培养。2.Nrf2抑制剂的鉴定2.1利用荧光素酶报告基因系统筛选抑制Nrf2活性的吡唑羟肟酸衍生物。2.2 RT-PCR检测Nrf2下游基因血红素加氧酶1(HO-1)和谷氨酰-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的表达情况。2.3在4f处理条件下,Western blot法检测AML细胞和A549细胞中Nrf2蛋白的变化。3.检测吡唑羟肟酸衍生物体外抑制肿瘤细胞生长的作用3.1细胞存活率检测:用细胞计数试剂8(CCK8)、磺酰罗丹明B(SRB)或噻唑兰(MTT)染色法检测细胞存活率。3.2细胞凋亡检测:1)采用流式细胞术检测AML细胞凋亡。2)用Western blot方法检测AML细胞caspase-3和PARP蛋白的切割。3)用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测肿瘤组织切片中细胞凋亡情况。4)用Hoechst33258染色检测A549细胞中染色体固缩和DNA片段化情况。3.3细胞周期检测:流式细胞术检测周期变化情况。3.4自噬检测:1)采用吖啶橙染料检测A549细胞中酸性膜泡的体积变化。2)采用Western blot方法检测A549细胞中LC3和p62/SQSTMl(p62)蛋白水平变化。3)免疫细胞化学法检测U87细胞中LC3-II的点状聚集在细胞内的分布。3.5细胞坏死检测:1)用流式细胞术检测AML细胞发生坏死的比例。2)用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测A549细胞释放LDH的情况。3.6检测线粒体凋亡信号通路:1)RT-PCR检测THP-1细胞中Bcl-2 mRNA水平变化。2)Western blot方法检测THP-1细胞中Bcl-2和Bax的蛋白水平变化。4.吡唑羟肟酸衍生物4f抑制肿瘤生长和血管发育的体内验证4.1利用鸡胚模型,检测化合物4f抑制肿瘤生长的效果。4.2利用鸡胚尿囊膜(CAM)模型,检测化合物4f对血管发育的影响。5.检测吡唑羟肟酸衍生物4f对胞内氧化还原平衡的影响5.1 GSH的检测:利用一种特异指示还原型GSH的探针来检测胞内GSH变化。5.2 GSH合成的检测:RT-PCR检测谷氨酰-半胱氨酸连接酶的催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM)基因表达的变化。6检测吡唑轻肟酸衍生物4f抑制Nrf2活性和诱导凋亡之间的相关性6.1利用Nrf2激活剂——特丁基对苯二酚(tBHQ)处理,检测THP-1细胞存活率以及凋亡蛋白(切割的caspase-3和PARP)水平的变化。6.2过表达Nrf2,检测THP-1细胞存活率和凋亡蛋白水平的变化。7.检测吡唑羟肟酸衍生物4f降低GSH和诱导自噬之间的相关性外加N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)处理,Western blot方法检测A549细胞中LC3蛋白水平的变化。研究结果1.新型吡唑到肟酸衍生物4f抑制Nrf2的活性我们利用荧光素酶报告基因系统,在一系列新型吡唑羟肟酸衍生物中筛选出化合物4f(5和10 μM,12和24h)能够显著抑制Nrf2的活性,并下调其靶基因HO-1和GCLC的表达。2.新型吡唑羟肟酸衍生物4f通过抑制Nrf2诱导AML细胞凋亡2.1化合物4f(5和10μM)显著抑制三种AML细胞(THP-1、HL-60和U937)的生长,IC50值分别为5.33、8.94和8.98μM。2.2化合物4f(5和10 μM,48 h)引起凋亡细胞数目增多,并诱导切割的caspase-3和PARP水平升高,并将AML细胞的周期阻断在S期。2.3鸡胚模型结果表明,化合物4f能够抑制体内肿瘤的生长并诱导细胞凋亡。2.4化合物4f降低AML细胞中Nrf2蛋白水平,tBHQ处理或过表达Nrf2均能减轻4f引起的细胞存活率的下降和凋亡。2.5化合物4f处理使Bcl-2 mRNA和蛋白水平降低,Bcl-2/Bax比值下降,因此化合物4f通过激活线粒体信号通路诱导AML细胞凋亡。2.6化合物4f能够抑制HUVECs和MS1细胞生长,也能抑制鸡胚尿囊膜血管的发育。3.新型吡唑羟肟酸衍生物抑制A549肺癌细胞生长3.1新型吡唑轻肟酸衍生物4a-41(5和10μM,24和48 h)均显著抑制A549细胞生长,其中化合物4b、4f、4h和4j效果最显著,IC50值分别为1.72、1.82、4.21 和 2.56 μM。3.2化合物4a-41(10 μM)引起A549细胞内酸性膜泡积累,但没有出现明显的染色体凝集和DNA片段化现象。3.3化合物4j(10μM,48 h)促进LDH释放,表明4j可能导致A549细胞坏死,而其他化合物并没有这种作用。3.4化合物4b、4f和4h将A549细胞周期阻断在G1期。3.5化合物4b、4f和4h显著诱导LC3-I向LC3-II转变,p62水平下降,表明这三种化合物均诱导A549细胞发生自噬。4.新型吡唑轻肟酸衍生物4f诱导A549细胞自噬的机制4.1化合物4f处理稳定转染GFP-LC3的U87细胞,LC3点状聚集明显增多,并以时间和浓度依赖的方式促进A549细胞中LC3-II蛋白积累。4.2化合物4f(5和10 μM,6和12 h)抑制mTOR底物——p70S6K和4EBP1的磷酸化蛋白水平,因此4f通过mTOR信号通路诱导A549细胞自噬。4.3化合物4f降低A549细胞中Nrf2蛋白水平。4.4化合物4f导致胞内还原型GSH含量下降,GCLC和GCLM基因表达也下降,抑制GSH合成;添加NAC能够减轻4f引起的GSH下降和LC3-Ⅱ升高。因此,GSH参与4f诱导的自噬过程。结论1.从一系列新型吡唑羟肟酸衍生物中筛选到一种有效的Nrf2抑制剂——1-(4-(叔丁基)苄基)-3-(4-氯苯基)-N-羟基-IH吡唑-5-羧酰胺(4f)。2.新型吡唑羟肟酸衍生物4f抑制Nrf2,激活线粒体信号通路,诱导三种AML细胞(THP-1、HL-60 和 U937)凋亡。3.新型吡唑羟肟酸衍生物4b、4f和4h抑制A549细胞生长效果较好,阻断细胞周期并诱导自噬发生。4.新型吡唑羟肟酸衍生物4f抑制Nrf2活性和GSH合成,造成胞内氧化还原状态失衡,诱导A549细胞发生mTOR依赖的自噬。