论文部分内容阅读
硫酸软骨素酶（简称ChSase）,可将硫酸软骨素等糖胺聚糖上的β-1,4糖苷键切断,生成的低分子量硫酸软骨素因具有粘度小、溶解性好、易吸收等特点而具有较高的生物学活性。本课题对各种含有ChSase基因的细菌进行筛选,以得到高表达量、有活力的ChSase。利用ChSase对硫酸软骨素进行酶法降解,通过紫外可见分光光度法对酶解产物含量进行测定,利用质谱方法对硫酸软骨素产物进行验证。本课题筛选出多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron CAG:40）菌株并克隆出3段编码ChSase的基因,并对其酶学性质进行研究。主要研究内容有:（1）实验选择的B.thetaiotaomicron CAG:40菌株中含有3种ChSase的基因,命名为ChSase-ABC I（Gene ID:524777996）、ChSase-ABC II（Gene ID:524777977）、ChSase-AC（Gene ID:524780449）,分别编码1025、892、719个氨基酸。（2）信号肽分析结果显示3种ChSase分别含有19、14、24个氨基酸为信号肽序列。以来源于B.thetaiotaomicron wal2926的硫酸软骨素裂解酶ABC（PDB ID:2Q1F）为模板,3种ChSase的序列一致性分别为30%,98%,34%,均可得到合理的目标模型。以B.thetaiotaomicron CAG:40基因组DNA为模板,成功克隆出3种ChSase并连接到表达载体pCzn1和pET-30a上,成功构建了3种重组原核表达载体。（3）对重组ChSase-ABC I进行表达及酶学性质表征。诱导ChSase-ABC I表达的最佳诱导剂浓度为0.75 mM,最适诱导温度是25 oC,最佳诱导时间为6 h。纯化后ChSase-ABC I纯度可达到95%以上且分子量约为108 kDa。ChSase-ABC I在70 mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液下具有较高的相对酶活。最适反应温度为37oC,且t1/2=120 min。Mg2+可以促进ChSase-ABC I的酶促反应速率。双倒数曲线图计算动力学参数,ChSase-ABC I的Km值和Vmax分别为0.54 mg/m L和541.3U/mg-protein。（4）当以硫酸软骨素A作为底物时,ChSase-ABC I催化反应生成的最终产物为质荷比为458.30的单硫酸化的不饱和二糖,表明ChSase-ABC I是一种通过降解硫酸软骨素的β-1,4糖苷键生成不饱和二糖的裂解酶。（5）对克隆到的ChSase-AC进行表达研究及酶学性质表征。该ChSase-AC的最佳诱导剂浓度为10μM、最佳诱导温度为15 oC、最佳诱导时间为20 h,且大部分以可溶性形式存在,经Ni-IDA纯化后在80 kDa出现明亮的单一条带。酶催化最佳pH为7.5,最适温度为35 oC。在37 oC中保温4 h仍有80%以上的相对活性。Ca2+可以促进ChSase-AC的酶促反应速率。