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猪器官、组织和细胞作为临床移植的供体源具有广泛和良好的前景，可缓解临床器官移植的器官相对短缺，也可为临床治疗Ⅰ-型胰岛素依赖型糖尿病，帕金森病、亨廷顿病、癫痫病等顽固性神经疾患提供一种治疗方法，并可作为治疗急性爆发性肝炎肝功能衰竭、急、慢性肾功能衰竭的过渡性措施。自Dr．Clive Patience(BioTransplant Inc．首席科学家)1997年报道猪内源性逆转录病毒(PERV)感染体外培养人细胞以来，猪异种移植过程中可能发生PERV种间传播的潜在危险已引起众多学者的广泛关注。 Patience等首先证实至少有三个PERV亚型在体外培养能感染人细胞，Takeuchi等通过假型实验也证实PERV感染体外培养人细胞株，Martin等通过感染性实验证实了PERV感染体外培养人细胞。以后许多学者从多方面对PERV的生物学特性进行了较为广泛和深入的研究。 目前已经证实猪内源性逆转录病毒为典型的哺乳动物C型逆转录病毒，并具有gag-pol-env基因组结构。Patience等从两株猪肾细胞株分离得到的天然病毒粒子，证实为典型的哺乳类C型逆转录病毒。Akiyoshi等鉴定小型猪淋巴细胞PERV(PERV-MSL)全长cDNA核酸序列，证实PERV-MSL是一种典型的C型逆转录病毒，其长度为8132bp，与长臂猿白血病病毒和鼠白血病病毒具有最大的核酸序列同源性。同时在多种猪器官和正常白细胞检出PERV-MSL RNA的结构产物。PERV-MSL的gag、pol、env的ORF氨基酸序列与Tsukuba-1逆转录病毒氨基酸序列的同源性＞99％，与胎猪肾细胞PERV(PK15-PERV)氨基酸序列具有高度同源性。我国猪种资源丰富，国内尚未开展猪内源性逆转录病毒生物学方面的实验研究。 体外实验已经证实了猪PERV对人细胞具有感染性，但在体感染性研究报道甚少。Van der Laan等通过建立非肥胖性糖尿病／严重联合免疫缺陷wOD用CID鼠胰岛细胞移植模型，首先证实猪胰岛细胞产生PERV，并在体外培养感染人细胞，并移植至NOD侣 鼠，检测鼠组织PEM RNA的表达，结果发现多种组织发生PERV感染，这是移植猪组织后体内PERV主动复制，也是在体种间交叉感染的首次报道。后来Deng等建立SCID鼠移植胎猪胰岛细胞模型，将胎猪胰岛移植于 SCID鼠，饲养 3＊ 周分别处死。取肝、脾、脑提取 DNA和 RNA，应用巢式 PCR和 RTPCR检查 PEM和扩增猪线粒体细胞色素氧化酶亚单位＊基因o），结果发现M4－肝和M19－脾组织的PERV阳性，COil阴性，这提示猪PERV向鼠组织传播己经发生，但检测 PERV RNA未发现鼠组织有活跃的 PERV复制的证据。这些结果初步表明猪细胞可以在体感染鼠组织。而近期有几宗接受活猪组织或细胞移植的临床病例的文献报道，但所有报道均表明未发现PERV感染的证据。临床结果与实验结果并不完全一致，因此PERV的在体感染性尚末到广泛的公认，有待进一步深入研究。 为此，本课题拟从猪外周血白细胞基因组存在的PERV基因序列及其差异性、各种猪组织PERV基因序列的mRNA丰度、猪皮肤成纤维细胞对人HEK293细胞的体外感染性和对SCID鼠的在体感染性入手，研究我国猪PERV的生物学特性、猪组织PERV的表达的高低幅度（高表达和低表达）及猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性，从而为猪－人间异种移植积累资料，为临床应用提供实验依据，为异种移植的生物安全性评价奠定基础。研究内容分为以下三部分：＊）猪外周血白细胞DNA猪内源性逆转录病毒序列的检测及差异性分析。主要了解我国猪资源的PERV生物学特性，为猪异种移植积累资料。p）两种小型猪不同组织 PERV m洲A丰度及其差异分析。了解备种组织PERV表达情况，以寻找PERV高表达和低表达器官或组织，为临床猪异种移植选择组织或器官提供实验依据。O）猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性实验研究。通过实验了解猪皮肤成纤维细胞PERV的对人HEK293细胞的体外感染性和对SCID鼠的体内感染性，为猪异种移植提供实验依据。 ·x· 本研究应用PCR、PCR－RFLP、SS－SSCP等技术分析12个品系猪外周 血白细胞基因组DNA的PERV基因序列片段及其差异，应用RT－PCR方 法分析广西巴马小型香猪和贵州小型香猪13种组织P＊RV基因序列m RNRNA 的表达及其差异，应用组织细胞培养方法、免疫组织化学、电镜技术建立 和鉴定猪皮肤成纤维细胞系，并将猪皮肤成纤维细胞与经过转染的具有抗 新霉素基因的人neo／HEK293细胞共培养，或将猪皮肤成纤维细胞移植于 SCID 鼠，探讨猪内源性逆转录病毒的体外和体内感染性，获得以下结果 和结论： 1．口个品系猪外周血白细胞 DNA池基因组普遍存在 PERV－A、 PERVI、PERV gag基因序列，分析各品系个体发现PERV（基因序列的 检出率约为 10％。应用逆转录病毒逆转录酶基因高度保守区序列为引物， 寻找新的逆转录病毒序列，未能发现新的逆转录病毒序列；应用SS七SCP 技术分析 12个品系猪外周血白细胞基因组扩增产?