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副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一种嗜盐型革兰氏阴性致病菌,能够在生物及非生物表面形成生物被膜,可能引起人恶心、呕吐、腹泻等肠胃炎反应及食物中毒等症状,严重的可能引发败血症进而导致死亡。生物被膜是被自身分泌的胞外聚合物所包裹的特殊结构,抗生素敏感性低,给水产养殖和人类健康造成严重威胁。本研究以副溶血性弧菌ATCC33847为研究对象,首先,探究了VP游离态和生物被膜态不同时间下的生长情况,通过平板计数法、结晶紫染色法、扫描电镜（SEM）、共聚焦显微镜（CLSM）和胞外聚合物（EPS）测定;在此研究的基础上,选取25℃下培养36 h的浮游菌和生物被膜菌进行转录组测序（RNA-seq）,通过分析差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,发现双组分信号传导系统（Two-component regulatory system,TCS）和群体感应（quorum sensing,QS）调控VP生物被膜的形成,影响细菌鞭毛的运动和胞外聚合物的分泌,QS与ABC转运系统相互作用,并于TCS存在正调控关系;此外,构建群体感应淬灭酶AiiA的重组蛋白载体,并进行表达和纯化,探究了AiiA酶对非生物表面生物被膜的抑制作用,通过结晶紫染色法和共聚焦显微镜观察对生物被膜的抑制作用。本研究初步探究了影响VP生物被膜的调控机制及为抑制其生物被膜形成提供了一个新的方法,为后续探究治疗细菌感染的新方法及解决细菌耐药性提供了理论基础和一定的技术支撑。本文的研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌游离态和生物被膜态的生物学特征研究。该实验以游离态和生物被膜态的VP为研究对象,菌液和含3%Na Cl的TSB培养基以1:99的比例于25℃下进行培养,通过平板计数法对活菌进行计数,发现浮游菌在10～18 h快速生长至约8 log CFU/m L,在23～24h时趋于稳定至约9 log CFU/m L,生物被膜菌先增加后减小,在36 h时活菌数最高至约8.4 log CFU/m L,通过结晶紫染色法观察生物被膜菌的形成量,36 h时生物被膜量最大(OD600=2.36),与平板计数结果趋势一致。通过SEM观察浮游菌和生物被膜菌的形态变化和差异,培养后期菌体均有破损和凹陷,生物被膜菌出现山峰状的立体结构。通过CLSM观察在不同时期形成的生物被膜的三维立体结构,VP于36 h形成厚且致密的成熟生物被膜,36 h后开始分散。最后通过苯酚-硫酸法和Lowry蛋白质分析试剂盒分析生物被膜的胞外多糖和胞外蛋白,得出胞外多糖和胞外蛋白有利于生物被膜的形成的结论。结果表明,VP游离态和生物被膜态生长过程存在差异。2.副溶血性弧菌游离态和生物被膜态的转录组分析。收集于25℃下培养的游离态和生物被膜态的VP,分别提取其RNA后进行文库构建和转录组测序,以Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633（NCBI accession:NC＿004603.1）基因组作为参考基因组对测序数据进行分析,与参考基因组的比对率分别为95.4514%和94.3078%,鉴定DEGs,结果共956个差异基因表达,并进行GO和KEGG富集分析,共注释到30个pathway类别,分析与生物被膜形成相关的调控机制。MCP和Rpo Z正调控VP TCS系统,σ54因子在特定TCS双组分系统条件下负调控QS,都与细菌的鞭毛相关。发现QS和TCS双组分系统存在正调控关系,共同调控生物被膜的形成,QS与ABC转运相互作用,通过影响胞外多糖和胞外蛋白质促进生物被膜形成。36 h时,不同的调控机制根据环境和自身变化分泌不同的信号来抑制或促进生物被膜的形成,维持细菌稳定的生长环境,此时VP的QS是opa R依赖性的,在细菌高密度环境下抑制生物被膜的形成,同时QS与TCS和ABC转运系统相互作用,促进生物被膜的形成和成熟。3.群体感应淬灭酶表达纯化及其对副溶血性弧菌生物被膜的影响。本实验以能产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌A24为模板,选用以卡那霉素为抗性基因的p ET28b载体进行质粒筛选,构建芽孢杆菌AiiA蛋白重组表达载体,选用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达菌株,成功表达出高丝氨酸内酯酶AiiA。AiiA酶对群体感应信号分子AHL具有降解作用,抑制群体感应效应,有效抑制VP生物被膜的形成。