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研究表明,牛蒡子苷元(arctigen,ARG)在人体内具有很强的抗炎作用。本研究通过构建神经炎症动物模型,旨在探讨ARG对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的神经炎症、神经生物学改变及认知功能障碍的保护作用及其可能机制。方法C57BL/6J雄性小鼠(体重22±2g)随机分为野生对照(Control)组,模型组(LPS,250μg/kg/d),牛蒡子苷元治疗组(ARG,100mg/kg/d),治疗药物单用组(ARG,100mg/kg/d)。连续腹腔注射LPS(250μg/kg/d)7天构建神经炎症动物模型,溶解于0.5%羧甲基纤维素的ARG在腹腔注射LPS前两周按剂量进行灌胃治疗,持续3周。Control组腹腔注射相同容量的0.9%无菌生理盐水和灌胃0.5%羧甲基纤维素钠作为对照。治疗结束后,通过Morris水迷宫检测实验动物认知能力。尼氏(Nissl)染色结合海马组织凋亡相关分子Caspese3和PARP1的表达检测海马神经元损伤;硫磺素S(Thioflavine-S)染色结合免疫荧光染色检测Aβ二聚体以及Aβ表达,进一步通过免疫印迹检测APP、BACE1的表达分析Aβ的生成;免疫荧光SYP和PSD95共染检测突触密度;免疫组化检测海马组织CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,免疫印迹检测小胶质细胞标志物IBA1和星形胶质细胞标志物GFAP的表达,通过ELISA分析脑组织炎症因子TNF-α、IL-6以及IL-1β的含量;免疫印迹检测TLR4/CD14/NF-кB信号的表达。同时我们用LPS作用的脑特异性巨噬细胞BV2细胞系诱导神经炎症反应,用CCK8法检测细胞活性,筛选合适的ARG给药浓度,用ELISA法检测不同浓度的ARG对BV-2细胞释放炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响,进一步通过免疫荧光检测TLR4/CD14/NF-кB信号的激活,研究ARG的抗炎以及神经保护作用。结果Morris水迷宫平台隐藏实验结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠寻找隐藏平台的潜伏期显著延长;而与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠寻找隐藏平台的潜伏期显著缩短(均p<0.05)。空间探索实验结果中,与Control组相比,LPS模型组小鼠在目标象限停留时间减少了31.4%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠在目标象限停留时间增加了30.7%。Nissl染色结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域尼氏小体分别降低41.5%、56.5%、58.4%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域尼氏小体分别增加34.1%、39.1%、35.9%。免疫印迹检测神经元损伤相关凋亡分子Caspese3和PARP1蛋白表达,发现与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织cleaved-capase3和cleaved-PARP1分别增加64%和48%;与模型组小鼠相比,ARG治疗组小鼠海马组织c l e a v e d-c a p a s e 3和cleaved-PARP1分别减少31.8%和36.7%。Thioflavine-S染色和Aβ免疫荧光染色结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内Aβ二聚体和Aβ含量显著增加;与模型组相比,小鼠海马组织内Aβ二聚体和Aβ含量显著下降。免疫印迹检测APP与BACE1的含量,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织APP和BACE1分别增加74.5%和58.6%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内APP和BACE1分别减少30.4%和31.6%。免疫荧光共染结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内突触密度下降43%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内突触增加36.9%。免疫印迹结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内突触标记物SYP和PSD95的表达分别下降39%和41.9%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内突触标记物SYP和PSD95的表达分别增加28.5%和59.9%。免疫组化结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞含量分别增加36.5%、48.2%和51.5%,星形胶质细胞含量分别增加46.4%、51.9%和23.5%;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内CA1、CA3和DG亚区域神经炎症小胶质细胞含量分别减少50.5%、46.3%和46.1%,星形胶质细胞含量分别减少41.7%、55.1%和39.6%。免疫印迹检测胶质细胞标记物结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织GFAP和IBA1含量增加,与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马组织内GFAP和IBA1显著减少。ELLISA结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠脑组织内炎症因子TNF-α、IL-6以及IL-1β含量显著增加,与模型组相比,ARG治疗组脑组织内炎症因子TNF-α、IL-6以及IL-1β的含量显著减少。免疫印迹结果显示,与Control组相比,LPS模型组小鼠海马组织内LPS靶向的TLR4及其下游CD14、p-IкBα和p-NF-кB蛋白表达水平显著上调;与模型组相比,ARG治疗组小鼠海马内TLR4、CD14、p-IкBα和p-NF-кB蛋白表达水平显著下降。CCK8法检测不同剂量的ARG(12.5,25,50,100μmol/L)对BV-2细胞活性的影响,结果显示,ARG(12.5,25,50μmol/L)不会影响细胞活性。ARG可抑制由LPS介导的小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放,并在50μmol/L时产生最佳效果。体外实验研究发现ARG抑制了BV-2小胶质细胞内TLR4介导的信号因子NF-кB的入核,进一步的说明了ARG通过TLR4信号通路抑制神经炎证。结论ARG抑制TLR4/NF-κB信号通路和神经炎症,减少Aβ的生成和聚集,进而缓解LPS诱导的突触失功能和神经元损伤,最终改善神经炎症诱导的认知障碍,并建议将ARG作为与神经炎症相关的神经疾病(如阿尔茨海默病)的治疗选择。