目的:胃癌在所有恶性肿瘤中,致死率高居第2位[1,2]。跟几乎所有恶性肿瘤一样,胃癌受多种因素调控。其中,幽门螺杆菌感染是一个不容忽视的因素。现代流行病学资料显示,幽门螺杆菌感染在胃癌的患病过程中有着明确的促进作用[3]。首先,幽门螺杆菌感染一定会导致胃部炎症,而时间大于10年的幽门螺杆菌感染,可致使浅表性胃炎发展为萎缩性胃炎,如果不干预感染的存在,萎缩性胃炎经过较长时间后,可以出现肠化生,最终导致癌变[4]。但是不是所有感染幽默螺杆菌的患者都会最终发展成胃癌。因此,幽门螺杆菌是如何致病的,其确切的机制还有待于研究[5,6]。本研究通过对数据库的挖掘,锁定胃癌组织中变化较明显及有临床意义的分子FAM60A,再通过对幽门螺杆菌及胃癌细胞相互作用研究,以该分子为导向,对幽门螺杆菌的致病机制进行深入系统的科学研究。旨在分子层面,为幽门螺杆菌的感染促进胃癌发生发展的机制提供新的研究思路和理论依据。研究方法:1.首先,我们通过搜索癌症相关的公共数据库Oncomine、TCGA、GEO等,预测已选择的目标分子在胃癌和健康胃组织中的表达,从而锁定差异表达的分子数据集A。在Kaplan-Meier在线数据库中分析并绘数据集A中各分子的相关生存曲线,从而确定其差异变化可能有临床意义的数据集B。再次通过数据库GEO的搜索,查找比较幽门螺杆菌感染胃组织与未感染胃组织分子表达差异的数据集C。汇总分析数据集,锁定数据集B和数据集C中交叉出现的分子FAM60A。2.选取54例胃癌患者成对的病理切片标本,即胃癌组织病理标本及相应的癌旁正常组织病理标本。应用免疫组织化学技术检测FAM60A在各病理组织中的表达水平,整理患者的临床病理资料数据,分析FAM60A表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期、肿瘤转移、幽门螺杆菌等因素的相关性,从而评价FAM60A对预估患者预后的意义及参与疾病发生发展过程的可能性。3.聚合酶链式反应及蛋白质印迹法检测了胃上皮细胞株GES-1和4种胃癌细胞株HGC-27细胞、AGS细胞、SGC-7901细胞、MGC-803细胞的FAM60A的基因水平及蛋白表达水平。选取FAM60A表达量中等的两株胃癌细胞系平行进行后续实验。培养幽门螺杆菌标准株ATCC 43504,将幽门螺杆菌标准株ATCC 43504与所选两株胃癌细胞系共培养,聚合酶链式反应、蛋白质印迹法检测细胞FAM60A m RNA水平及蛋白水平变化,使用小干扰RNA预先敲减FAM60A,再将两株胃癌细胞分别与幽门螺杆菌共培养,同时设置空白组及对照组,检测各组细胞的生物学行为差异。用CCK-8及克隆形成实验检测增殖,流式细胞术检测凋亡和细胞周期,细胞划痕实验检测胃癌细胞的迁移情况,Tranwell实验检测胃癌细胞的侵袭情况。4.再设计过表达FAM60A的慢性毒载体,转染上述所选的两株胃癌细胞,设置空白组及对照组,再次通过上述实验检测细胞的增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭等生物学行为的变化。通过蛋白质印迹实验检测与凋亡、周期、迁移、侵袭相关的蛋白bcl-2,bax,caspas3,cleaved caspas3,cyclin A,cyclin D,MMP9,MMP2等指标的表达变化。5.随后在幽门螺杆菌感染,敲减及过表达FAM60A的等不同分组处理的情况下,蛋白质印迹法检测上述所选的两株胃癌细胞中包括PI3K/Akt等通路的变化,对变化明显的通路,使用通路抑制剂如PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002,做回复实验及检测细胞生物学行为的实验进一步验证通路在所研究病理过程中的意义。结果:1.(1)Oncomine等数据库中的多项数据显示,胃癌组织中FAM60A的表达水平高于癌旁正常组织(P<0.05)。(2)Kaplan-Meier在线数据库中,以胃癌患者的生存预后为背景,以FAM60A为目标,制作生存曲线显示FAM60A的表达水平与胃癌患者的预后密切相关,高水平的FAM60A对应较差的胃癌患者预后(P<0.05)。(3)GEO数据库中一项以幽门螺杆菌感染的小鼠细胞模型为对象的测序研究显示,感染过幽门螺杆菌的小鼠胃粘膜细胞,其FAM60A的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。2.54对临床病理样本中,有42对样本得到了完整的FAM60A免疫组化检测结果。对免疫组化的半定量统计结果显示,胃癌组织中FAM60A蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)。对胃癌组织中FAM60A表达量与患者的临床病理参数的相关性进行统计分析,结果显示,胃癌组织中FAM60A的表达情况与患者的肿瘤大小,是否存在淋巴结转移,肿瘤的TNM分期,是否存在幽门螺杆菌感染等因素明显相关(P<0.05)。3.4株胃癌细胞中FAM60A表达量均明显高于为上皮细胞系GES-1;4株胃癌细胞株中,FAM60A表达量中等的两个胃癌细胞株是HGC-27细胞和AGS细胞,选择此两株细胞平行进行后续实验。两株胃癌细胞HGC-27、AGS分别与幽门螺杆菌标准株ATCC 43504共培养后,聚合酶链式反应及蛋白质印迹法检测FAM60A的表达水平明显增高,并随着共培养实验延长,其增高趋势越来越明显。对细胞生物学行为检测的结果显示,两株胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强,凋亡能力减弱,细胞周期G0/G1期缩短(均有P<0.05)。预先敲减FAM60A的胃癌细胞,其各种生物学行为的变化较前得到回复。4.在胃癌细胞株HGC-27、AGS中过表达FAM60A后,细胞增殖、迁移、侵袭能力增加,凋亡能力减弱(均有P<0.05),细胞周期G0/G1期缩短(P<0.05),这些变化与胃癌细胞在与幽门螺杆菌共培养处理时的结果相同。加入PI3K/Akt通路抑制剂后,各种生物学行为与之相反。5.胃癌细胞株HGC-27、AGS与幽门螺杆菌共培养后,蛋白质印迹法结果显示PI3K/Akt通路中的效应蛋白p-Akt表达水平升高(P<0.05);在胃癌细胞HGC-27、AGS中敲减FAM60A,p-Akt的水平降低(P<0.05);在胃癌细胞株HGC-27、AGS过表达FAM60A后,p-Akt水平升高(P<0.05),加入通路抑制剂LY294002后,升高的p-Akt水平得到逆转。细胞生物学行为实验检测结果及体外裸鼠肿瘤实验结果显示,加入通路抑制剂LY294002后,过表达FAM60A所引起的变化可以得到回复。结论:1.胃癌组织中FAM60A蛋白表达水平明显增高;FAM60A的蛋白表达水平与预后相关,FAM60A蛋白表达越高,患者预后越差;FAM60A的蛋白表达水平与幽门螺杆菌感染相关,幽门螺杆菌感染可以增加胃癌组织中FAM60A的蛋白表达。2.幽门螺杆菌感染胃癌细胞HGC-27和AGS,可以促进细胞生长,促进细胞迁移、侵袭,而FAM60A参与了幽门螺杆菌调控胃癌细胞生物学行为的过程。3.胃癌细胞HGC-27和AGS中,过表达FAM60A,可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞迁移和侵袭,而PI3K/Akt通路可以在下游被过表达FAM60A激活。4.在幽门螺杆菌促进胃癌细胞中FAM60A高表达,进而发挥促进增殖、抑制凋亡、促进细胞迁移和侵袭等作用的过程中,都有PI3K/Akt通路的参与。