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旋蒴苣苔(Boea hygrometrical)是在我国广泛分布的一种复苏植物,能够耐受极度脱水,以类似于休眠的方式度过干旱期,在水分适宜后又能迅速恢复正常生活状态。我们从旋蒴苣苔脱水2h的cDNA文库中筛选到两个脱水诱导表达的cDNA片段,经5RACE得到cDNA全长。其中一个共1197个碱基,编码398个氨基酸,通过NCBI保守结构域分析,发现它含有两个结构域:细胞色素b561(cyt b561)结构域和多巴胺β=羟化酶(DoH)结构域;另外一个长度为465bp,编码154个氨基酸,仅含有一个C2结构域。分别将两个基因命名为BhDoh-b561和BhC2DP1。通过5RAGE的方法分别克隆了1157bp BhDoh-b561启动子序列和1113bp的BhC2DP1启动子序列。PLACE软件分析启动子序列发现两者均含有多种逆境胁迫诱导元件。
BhDoh-b561启动子序列中有2个ABA响应元件ABRE和2个生长素响应元件ARFAT和NTBBF1ARROLB。构建PrOshDoh-b561:GUS植物表达载体,转化拟南芥,发现GUS活性在子叶中表达较强,在成熟的植物中表达变弱;脱落酸(ABA)或生长素处理的转基因植株中GUS活性相比于未处理对照有所增强,表明BhDoh-b561可能参与对两种激素的响应。在BhDoh-b561-GFP瞬时表达的小烟草表皮细胞中,只在膜系统上检测到GFP信号,证明BhDoh-b561是膜定位的蛋白。
BhC2DP1启动子中含有3个拷贝的Ca2+/Calmodulin结合序列和2个同时响应ABA和Ca2+的ABRE-CE元件。qRT-PCR和GUS染色结果表明BhC2DP1的表达主要受5mM Ca+短时处理诱导;分别施加Ca2+螯合剂EGTA和逆境激素ABA均抑制该基因表达,但二者同时处理则显著诱导其表达,表明BhC2DP1对ABA的响应依赖于Ca2+。
为了研究这两个基因的功能,我们分别构建了由CaMV35S驱动的过表达载体,获得了纯合的转基因拟南芥和转基因烟草,并对其进行表型分析。鉴于这两个基因的表达受到逆境和激素的诱导,我们研究了BhDoh-b561和BhC2DP1转基因植物在逆境和外源激素处理下的表型变化。
过表达BhDoh-b561的拟南芥相比于野生型具有开花较晚的表型。与野生型相比,过表达BhDoh-b561的烟草耐脱水性有所提高(过表达BhDoh-b561拟南芥并没有表现出比野生型更高的耐脱水性),因此BhDoh-b561在提高植物的抗旱性上能发挥一些作用。过表达BhDoh-b561的拟南芥对高盐(130mM NaCl)也有一定的敏感性,表现在叶片小且地上部生物量较小,有部分植株叶原基部分变黄变黑。BhC1DP1过表达BhDoh-b561的拟南芥在外源ABA处理下,生长受到严重抑制,表现在子叶不能变绿、子叶伸展以及根的伸长受到抑制等,相比之下,野生型受到的抑制较为缓和。我们发现过表达BhDoh-b561的拟南芥在与野生型受到同样剂量IAA、NAA和2,4-D处理时,地上部和地下部受到抑制的程度明显比野生型严重,而生长素输出抑制剂TIBA可缓解NAA对过表达BhDoh-b561的拟南芥的抑制作用。NAA的输入不需要载体,能通过自由扩散进入细胞,而在输出细胞时需要载体协助,所以TIBA可能通过抑制NAA输出细胞而缓解N从对植物生长的抑制作用,而BhDoh-b561蛋白有可能在生长素输入输出细胞过程中发挥作用。因此BhDoh-b561可能同时参与了ABA和生长素在植物体内的活动,进一步的研究有助于我们深入解析BhDoh-b561在植物体内的功能。
过表达BhC2DP1的拟南芥相比于野生型更能耐受PEG胁迫处理。在拟南芥中过表达BhC2DP1导致植株对ABA的敏感性增强,表现在种子萌发和幼苗根生长受到的抑制作用增加。EGTA处理可消除过表达BhC2DP1的拟南芥与野生型在ABA敏感性方面的差异,表明Ca2+是BhC2DP1蛋白参与植物对ABA的反应中所必须的。上述结果为进一步揭示植物特有的C2结构域小蛋白的功能与其表达的精细调控提供了基础。