慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病,气流受限不完全可逆、呈进行性发展,与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD的进展导致肺动脉高压,其主要机制为缺氧性肺血管收缩、肺血管内皮功能失调和肺血管重塑。肺血管一系列病理生理改变是COPD病程进展中重要的组织病理改变,本研究通过比较正常病人及COPD病人肺血管对于不同药物的反应,探讨COPD病人肺血管舒缩功能是否发生改变,为COPD病人应用药物提供临床依据。材料和方法1标本来源本研究人体标本来源于2011年10月1日-2012年6月4日在广东省肺癌研究所因肺癌行肺叶切除手术的病人。ASA分级Ⅰ～Ⅱ级。术前均告知病人标本采集过程与用途,并签署标本采集知情同意书。本研究已通过广东省医学伦理委员会伦理审批(粤医科伦理2010079H号)。选取距离癌组织边缘5cm以上的周围正常肺组织作为实验标本。所有病人均于术前7天内行肺功能检查。COPD的确诊标准参照2007年中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》。依照肺功能检查报告,以(FEV1/FVC)×100%<70%作为标准,将病人分为对照组和COPD组。2血管环制备肺组织从病人身上切除后,洗净残血,将肺组织固定于装有预冷的平衡液(Krebs-Henseleit液,K-H液)(4℃)的硅胶板上,显微镜下寻找直径约0.5～1mm的肺内小动脉,分离周围粘连的肺组织及支气管、肺静脉等。制备长度为1.5-2mm的动脉环,用两根直径为40μm的不锈钢丝穿过管腔。将血管固定于张力测定仪上,平衡60min,期间每隔15min更换K-H液1次,调节基础张力使其维持在1.8-2mN。浴槽内持续通入95%O2+5%CO2混合气,温度恒定在37℃,模拟人体内环境。实验中需制备机械损伤内皮血管,用不锈钢钢丝在穿过血管腔时来回摩擦血管壁数次,以破坏血管内壁上的内皮细胞。3血管功能性检测3.1检测血管反应性制备好的肺动脉环在浴槽中模拟人体内环境平衡60min后,调节基础张力至1.8～2mN,前负荷变化稳定后把浴槽内的K-H液换成预热的60mmol/L高钾溶液。60mmol/L高钾使肺内小动脉收缩,待血管收缩张力变化稳定至一平台期,以K-H液充分洗净(冲洗4次,每次间隔5min)至张力恢复至基线水平。平衡60min后,重复上述步骤2次。以后两次加入高钾溶液前后平均血管张力改变幅度小于3mN作为反应性差的界定标准,反应性差的血管舍弃不用。经血管反应性检测,共纳入130条血管作为实验样本,其中正常对照组67条,COPD组63条。3.2检测血管对不同血管活性物质的反应性平衡血管环60min,调节基础张力至1.8-2mN,前负荷变化稳定后加入60mmol/L高钾溶液,观察并记录血管张力变化幅度。以K-H洗净,如前述平衡并调整前负荷后加入U46619100nmol/L,观察并记录血管张力变化幅度。以K-H洗净后,如前述平衡并调整前负荷后加入内皮素(endothelin,ET-1)30nmol/L,观察并记录血管张力变化幅度。3.3检测吲哚美辛孵育后对U46619作用的影响16条经高钾溶液检测后血管活性好的血管(对照组9条,COPD组7条),张力恢复至基线水平后平衡血管环60min,调节基础张力至1.8-2mN,前负荷变化稳定后加入U46619100nmol/L,反应稳定后以K-H洗净,张力恢复至基线水平后平衡血管环60min,然后加入吲哚美辛10μmol/L孵育30min,调节基础张力至1.8-2mN,前负荷变化稳定后再次加入U46619100nmol/L,反应稳定后,以K-H洗净,观察并记录上述过程中血管张力的变化。3.4测定丙泊酚对静息状态下人肺内小动脉的作用选取24条肺功能正常病人的肺血管环,以不同方式处理内皮,在K-H液中平衡60min,调节基础张力至1.8-2.0mN,前负荷变化稳定后累积加入丙泊酚1、3、10、30、00、300、1000μmol/L,记录张力的变化。3.5测定血管内皮完整性及丙泊酚对人肺内小动脉作用与血管内皮的相关性选取24条肺功能正常病人的肺血管环,按照随机数表法将其分为3组,分别为内皮完整组(N组)、机械去内皮组(D组)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制内皮功能组(L组)。N组不予任何处理；D组用不锈钢钢丝摩擦损伤内皮细胞；L组血管加入L-NAME10μmol/L孵育30min。调整前负荷后加入U46619100nmol/L收缩血管,待血管张力平衡后加入乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)1μmol/L。若血管舒张幅度大于60%,视为内皮完整；若舒张幅度<60%,视为去除内皮。以K-H液洗净上述经内皮完整性检测的肺动脉血管环,张力恢复至基线水平后平衡血管环60min,加入U46619100nmol/L预收缩3组血管,张力稳定后累积加入丙泊酚1、3、30、100、300、1000μmol/L,记录张力的变化,观察丙泊酚对预收缩肺内小动脉的作用及其作用与内皮完整程度的相关性。3.6测定丙泊酚对预收缩人肺内小动脉的作用选取42条肺动脉环,其中正常对照组22条,COPD组20条。分别先后加入60mmol/L高钾溶液、U46619100nM/L、ET-130nM/L预收缩血管,药物引起预收缩张力达到稳定值后累积加入丙泊酚1、3、10、30、100、300、1000μmol/L,同时选取正常及COPD病人肺动脉环各4条加入等体积丙泊酚溶剂DMSO作空白对照,观察并记录张力的变化。4统计学处理测试肺内小动脉对血管收缩剂反应性时,以60mmol/L高钾溶液诱发的血管最大收缩幅度为100%,加入药物后血管收缩与最大收缩幅度的比值反映血管张力的变化。以两组吲哚美辛孵育前后下降或上升百分比来反映血管张力的变化。测试丙泊酚对肺内小动脉的作用时,以药物预收缩诱发的血管最大收缩幅度为100%,加入药物后血管舒张与最大收缩幅度的比值反应血管张力的变化,Emax表示最大舒张或收缩百分比,EC50表示产生50%最大舒张效应时对应的药物浓度,]pD2=-lg(EC50),表示引起最大效应的一半时所需的药物摩尔浓度的负对数,量效曲线应用GraphPad (prism3.0)绘制和分析。数据用均数±标准差(x±s)表示,统计学软件采用SPSS13.0.两组间计数资料比较用卡方检验,两组间计量资料比较用独立样本t检验,孵育前后张力改变百分比分别用单样本t检验。丙泊酚作用与内皮相关性实验中,三组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,三组间舒张率比较用重复测量方差分析,三组间舒张率与内皮舒张率的关系用直线相关分析。丙泊酚舒张正常及COPD病人肺内小动脉实验中,两组间舒张率比较用重复测量方差分析。以p<0.05作为有统计学差异。结果1.U46619对通气功能正常病人与COPD病人肺内小动脉的作用U46619引起对照组(n=20)与COPD组(n=20)肺内小动脉持续性收缩,直至达到张力稳定的平台期。对照组与COPD组对U46619引起的收缩张力变化的绝对值均数分别为7.68±2.31mN、5.89±2.43mN,组间比较有统计学差异,p<0.05。对照组、COPD组与高钾溶液收缩幅度的标准比值分别为137%±28%、118%±40%,组间比较有统计学差异,p<0.05。2.ET-1对通气功能正常病人与COPD病人肺内小动脉的作用ET-1引起对照组(n=20)与COPD组(n=20)肺内小动脉持续性收缩,直至达到张力稳定的平台期。两组对ET-1引起的收缩张力变化的绝对值均数分别为5.97±2.08mN、3.99±2.15mN,组间比较有统计学差异,p<0.01。对照组、COPD组与高钾溶液收缩幅度的标准比值分别为113%±34%、81%±35%,组间比较有统计学差异,p<0.01。3.60mmol/L高钾溶液对通气功能正常病人与COPD病人肺内小动脉的作用高钾溶液引起对照组(n=20)与COPD组(n=20)肺内小动脉持续性收缩,直至达到张力稳定的平台期。两组病人对高钾溶液引起的张力变化均数分别为5.65±1.70mN、5.02±1.38mN,组间比较无统计学差异。4.吲哚美辛孵育对U46619收缩肺内小动脉的影响吲哚美辛孵育前后,U46619均能引起肺内小动脉收缩。对照组(n=9)孵育前张力为5.23±2.80mN,孵育后为2.6±1.65mN,以孵育前后差值与孵育前血管张力的比值反映张力变化,孵育后张力下降百分比39%,单样本t检验孵育前后比较有统计学意义,p<0.01。COPD组(n=7)孵育前张力为5.21±1.85mN,孵育后为4.28±3.09mN,以孵育前后差值与孵育前血管张力的比值反映张力变化,孵育后张力上升百分比5%,单样本t检验孵育前后比较无统计学意义,p>0.05。吲哚美辛孵育前后,正常组与COPD组张力变化幅度无明显差异,独立t检验比较p>0.05。5.丙泊酚对静息状态下人肺内小动脉的影响在基础张力1.8-2.0mN的静息状态下,浓度1～1000μmol/L的丙泊酚对不同方式处理内皮的正常病人的肺内小动脉(N组(n=8)：内皮完整组；D组(n=8)：机械去内皮组；L组(n=8)：L-NAME阻断内皮组)不引起收缩或舒张效应。6.内皮对丙泊酚舒张人肺内小动脉的影响以不同方式处理血管内皮,丙泊酚均能呈浓度依赖性舒张U46619预收缩的肺内小动脉。经重复测量方差分析,三组间舒张率不全相等。经LSD两两比较,N组与D组舒张幅度无显著统计学差异,p=0.392>0.05,L组舒张幅度与N组、D组相比,分别有显著统计学差异,p分别为0.003和0.019。经计算各组内皮舒张率分别N组=(85.52±11.51)%；D组=(42.04±6.22)%;L组=(22.81±8.79)%。Emax:N>D>L。内皮舒张率：N>D>L。对24例标本进行双变量相关分析,二者相关系数r=0.872,p=0.000,两者存在显著正相关关系。7.丙泊酚对预收缩人肺内小动脉的作用丙泊酚能舒张由60mmol/L高钾溶液、U46619、ET-1预收缩的肺功能正常病人和COPD病人肺血管,其舒张效应呈浓度依赖性。无论是非受体依赖的高钾溶液,或是受体依赖的U46619和ET-1预收缩的肺动脉环,30μmol/L的丙泊酚开始对其产生舒张作用,随着丙泊酚累积浓度增加,其舒张效应也逐渐增强。丙泊酚的舒张肺内小动脉呈明显的量效依赖关系,舒张幅度与丙泊酚药物浓度成正比。当丙泊酚累积浓度超过300μmol/L时,量效曲线图坡度变缓,反映超出300μmol/L丙泊酚舒张血管幅度不再大幅增加。丙泊酚对高钾溶液预收缩的COPD病人肺动脉环舒张幅度较正常对照组病人下降,p<0.05。结论1.COPD病人肺内小动脉对外源性血栓素类似物U46619及内皮素ET-1反应性较正常人下降。2.COPD病人肺内小动脉收缩功能下降的机制可能与COPD发生发展过程中机体长期耐受内源性高血栓素、高内皮素有关。3.丙泊酚呈浓度依赖性舒张正常人及COPD病人肺内小动脉。4.丙泊酚通过作用血管平滑肌细胞和内皮细胞引起预收缩的人肺内小动脉舒张,内皮完整与否影响其舒张效应。