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普鲁兰酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键,从而剪下整个侧支,形成直链淀粉的解支酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用途,可大规模地提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶可以单独使用,亦可与其它酶配合使用,相辅相成收到良好的效果。当前较成熟地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和干啤酒生产中。 本论文以Bacillus naganoensis(ATCC53909)为研究对象,克隆并在毕赤酵母中表达了编码普鲁兰酶的基因。同时,通过对重组毕赤酵母发酵条件的优化以及重组普鲁兰酶粗酶酶学和应用特性的研究,为普鲁兰酶的蛋白质工程提供理论基础,并为该酶的高效表达和以后的应用奠定基础。 本论文的主要内容有四个部分:1.Bacillus naganoensis(ATCC53909)普鲁兰酶基因的克隆;2.普鲁兰酶基因在毕赤酵母中的表达:3.重组毕赤酵母发酵条件的优化:4.重组普鲁兰酶粗酶的酶学和应用性质研究。 具体的研究结果和结论如下: 1.以Bacillus naganoensis(ATCC53909)细菌总DNA为模板,根据已报道的Pullulanase 基因序列设计引物,成功克隆出了普鲁兰酶基因,序列测定结果表明与已报道的Pullulanase基因序列完全一致。 2.将克隆得到的普鲁兰酶基因片段通过EcoR I位点,以正确的ORF与酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列3’端融合,构建成重组表达载体pPIC9K-Pullulanase。重组酵母表达载体经Sac I线性化后电击转化表达宿主SMD1168,经普鲁兰酶活性检测、SDS—PAGE及酵母基因组DNA的PCR扩增分析表明,普鲁兰酶基因在SMD1168中得到了正确的表达和修饰,转化子P8实验室摇瓶发酵时,酶活最高可达350.8U/mL(是出发菌株的约129.9倍)。重