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三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)是从传统中药三七(Panax noto ginseng(Burk)F.H.Chen)块根中提取的一种有效成分,是三七的主要有效成分,因具有良好的活血化瘀作用而广泛应用于脑缺血疾病的临床治疗。研究发现,三七总皂苷能够发挥缺血后脑保护作用,并改善缺血后脑内血液循环状况。对三七总皂苷改善脑血液循环的机制已经有许多研究,然而,其上游的分子机制尚有待进一步探究。本课题组通过前期基因芯片检测,发现拟缺血损伤后的脑微血管内皮细胞(Brain MicrovascμLar E ndothelial Cells,BMECs)的胞浆型磷脂酶 A2IVA(phospholipaseA2groupIVA,PLA2G 4A)mRNA显著过表达,而三七总皂苷则可以抑制拟缺血损伤后BMECs中PLA2G4A mRNA的过表达。PLA2G4A是一种广泛存在于机体中的代谢调节酶,其可特异性分解细胞膜磷脂合成花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),AA又是多种活性产物的上游源头,这些活性产物合成后会参与血管内凝血、血管收缩功能等多种生理及病理进程,在脑缺血后损伤发挥重要作用。因此我们推测PLA2G4A mRNA的过表达与脑缺血后脑病理过程有关联性,而抑制PLA2G4A mRNA过表达,则可能是三七总皂苷发挥脑保护及改善脑血流作用的机制之一。因此,本实验在前期研究基础上,设计实验观察三七总皂苷对拟缺血损伤内皮细胞PLA2G4A mRNA及其下游产物的调节作用,以期深入探索三七总皂苷发挥脑保护及改善脑血流作用的上游分子机制。目的:探究三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞的PLA2G4A mRNA和蛋白以及其下游产物的调控作用,探索三七总皂苷发挥脑保护及改善脑血流作用的上游机制,为三七总皂苷发挥脑保护及改善脑血流作用提供依据,探寻脑缺血疾病防治新的靶点。方法:1.将从SD大鼠幼鼠脑部分离的大鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,经过纯化和两次传代,得到第三代的脑微血管内皮细胞。对将第三代细胞作为实验对象给予氧糖剥夺(Oxygen-Glucose-Deprivation,OGD)干预的造模,建立脑血管内皮细胞血氧缺乏模型。2.实验观察OGD造模后脑微血管内皮细胞PLA2G4A mRNA和蛋白的表达:将第三代内皮细胞分为PNS组、OGD模型组、空白组三组分别进行处理后,采用RT-PCR和Western Blotting法分别检测PNS组、OGD模型组、空白组脑微血管内皮细胞的PL A2G4A mRNA和蛋白的表达水平。3.PLA2G4A抑制剂浓度筛选,Pyrrophenone是PLA2G4A特异抑制剂,可抑制其合成花生四烯酸的功能。以第三代大鼠脑微血管细胞作为实验对象,设置若干抑制剂浓度梯度,并OGD造模,后用ELISA法检测Pyrrophenone对OGD造模后的内皮细胞AA生成量的影响,并计算出Pyrrophenone对花生四烯酸的半抑制浓度(IC50)作为实验浓度。4.观察三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞中的PLA2G4A下游产物花生四烯酸的调控作用:将第三代大鼠脑微血管内皮细胞分为正常组、OGD模型组、三七总皂苷组及Pyrrophenone组共四组。分别给予相应处理后,使用ELISA法检测各组花生四烯酸的合成量。5.观察三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞中20-HETE、TXA2/PGI2的影响:将三代脑微血管内皮细胞分为四组:正常组、OGD模型组、三七总皂苷组及抑制剂组。分别给予相应处理后,采用ELISA法检测并计算各组细胞中TXA2/PGI2,20-HETE的情况。结果:1.本实验观察到,PLA2G4A在脑微血管内皮细胞上表达。2.OGD造模可诱发脑微血管内皮细胞的PLA2G4AmRNA和蛋白过表达:与正常组比较,OGD组的PLA2G4AmRNA和蛋白水平显著增加。3.三七总皂苷明显抑制OGD诱导的脑微血管内皮细胞PLA2G4AmRNA和蛋白表达:通过RT-PCR和Western Blotting结果可知,与模型组相比,三七总皂苷组经OGD造模后PLA2G4AmRNA和蛋白表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.001。4.三七总皂苷抑制OGD诱导的脑微血管内皮细胞PLA2G4A产物花生四烯酸的过表达,通过Elisa法可以得知,与模型组相比较,三七总皂苷下调OGD诱导的花生四烯酸表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。5.三七总皂苷和Pyrrophenone可下调拟缺血损伤后脑微血管内皮细胞的TXA2/PGI2比例及20-HETE表达量。ELISA结果显示:与正常组相比,OGD模型组的TXA2/PGI2比例升高,20-HETE表达量明显过表达;与OGD组比较,三七总皂苷组和Pyrrophenone组细胞的TXA2、PGI2、20-HETE表达量显著下降(P<0.01),差异具有统计学意义。结论:1.本实验观察到PLA2G4A在大鼠脑微血管内皮细胞表达,拟缺血损伤后PLA2G4A mRNA和蛋白水平均明显上升,而三七总皂苷则可以抑制造模带来的PLA2G4AmRNA和蛋白水平的上升。2.三七总皂苷可有效下调造模后内皮细胞的前炎症因子AA及其其下游TXA2、PGI2、20-HETE的过表达,这可能与三七总皂苷抑制PLA2G4AmRNA和蛋白生成相关,PLA2G4A蛋白的过表达则可能是诱发AA及其下游产物过表达的原因。抑制PLA2G4A mRNA及蛋白的表达,以下调AA表达量及其下游产物表达量,可能是三七总皂苷在缺血性脑损伤中发挥改善脑血流作用的机制之一。