论文部分内容阅读
目的:眼底的新生血管性疾病是全球人群的首位致盲性眼病,包括年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR),两者均能引起严重的视力下降,其不可逆性损伤的最主要原因是新生血管的形成。由于我国人口老龄化的加剧,AMD和DR的发病率在逐年升高。因此,此类疾病的切实可行的治疗方案亟需完善。由于这两类疾病的发病机制目前还不明确,主要的研究表明病是由环境和基因共同决定的。年龄因素、遗传易感性、高血压、环境影响、强光暴露以及节食、吸烟是AMD发生的主要危险因素。高血压、高血糖、糖尿病病程、种族和性别、糖尿病发生时间、白内障摘除术以及妊娠是DR进展的主要相关因素。近年来,血管内皮的生长因子系统和整合素信号通路的研究越来越热,已发现脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)发生发展与此密切相关。其中,HM-3是含有RGD序列的多肽,由18个氨基酸组成,RGD序列可与整合素特异性结合,参与其信号通路,对新生血管内皮的生长起到抑制作用。此外,前期研究还发现HM-3有内皮抑素的活性,已在体内外实验中证实其抗氧化、抗炎、抗肿瘤及抗新生血管的作用,有望成为一种新型的治疗实体肿瘤的药物。然而,体内药物代谢动力学分析显示HM-3的循环半衰期较短,易降解,多次给药后方能达到预期疗效。HM-3经PEG修饰的产物mPEG-SC20k-HM-3,是通过活性筛选获得的具有延长HM-3半衰期、提高HM-3活性以及降低免疫反应性的一种抗新生血管多肽。而在糖尿病的发展过程中,作为中药单体的黄芪甲苷被发现可以通过抑制肝糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性,抑制晚期糖基化终产物形成而发挥降糖作用。因此,本课题在前期研究的基础上,首先探讨mPEG-SC20k-HM-3经玻璃体腔注射后的药效,其次探讨黄芪甲苷单体给药后对实验动物眼部病变的影响,为mPEG-SC20k-HM-3药物的新药开发以及寻求黄芪甲苷单体新的适应症打下基础,同时也为其他抑制眼部新生血管类药物的研发提供参考。方法:第一部分主要从四方面着手,探讨mPEG-SC20k-HM-3药物的药代动力学和药效学。首先,利用激光对小鼠眼球进行CNV造模,以HM-3,Avastin为阳性药物参照,以生理盐水,PEG辅料为阴性对照,将mPEG-SC20k-HM-3药物分高、中、低三个不同剂量组(给药量分别为4.59mg/kg,9.18mg/kg和18.35mg/kg小鼠体重,给药量按照玻璃体腔注射等摩尔HM-3药物推算),玻璃体腔注入各实验组药物后进行眼底自发荧光和荧光血管造影检测,观察并记录、分析脉络膜的荧光素渗漏面积,来观察药物对CNV渗漏作用的影响。其次,对高糖培养24小时后的人视网膜血管内皮细胞(HRVECs)进行细胞增殖和迁移检测,观察高糖对细胞生长的影响,再以HM-3,Avastin为阳性药物参照,以生理盐水,PEG辅料为阴性对照,将mPEG-SC20k-HM-3药物分高、中、低三个不同剂量组,在高糖刺激24h后,更新培养基,分别给予不同药物,观察药物对高糖刺激下人视网膜血管内皮细胞的作用。随后,研究mPEG-SC20kHM-3在在体和离体条件下的抗眼部新生血管的药效学机制。在前两部分实验中,我们取出造模7天后的新鲜小鼠眼球并分离组织获得脉络膜样本,对培养皿中的HRVECs分离提取细胞样本,以PCR法检测HRVECs细胞中血管内皮生长因子在mRNA水平的表达情况;以免疫印迹法检测体内外VEGF,PI3K和HIF-1α的表达量。再次,我们对mPEG-SC20k-HM-3药物在体内的药物代谢动力学进行初步研究,以间接竞争ELISA法探讨在玻璃体腔注射等摩尔数mPEG-SC20k-HM-3和HM-3后,不同时间点各个组织中的药物代谢参数,来了解药物在眼球和血液中的代谢分布情况。第二部分,关于中药单体黄芪甲苷抗眼部糖尿病视网膜病变的实验研究,首先通过图行视网膜电图检查来观察黄芪甲苷对db/db小鼠视网膜功能改变的影响,其次探究黄芪甲苷单体抗视网膜病变的机制,对视网膜组织和血细胞中的醛糖还原酶活性进行检查,以免疫印迹法和表达谱基因芯片检测视网膜中与眼部视网膜病变相关的信号分子的表达情况。结果:第一部分,在体内实验中,我们发现,与阴性对照组(包括生理盐水对照和PEG辅料对照)相比,mPEG-SC20k-HM-3治疗组的CNV渗漏面积明显减少(P<0.05)。在给药组间比较,Avastin组和中剂量、高剂量的mPEG-SC20k-HM-3 治疗组(9.18mg/kg 和 18.35mg/kg 给药组)以及 HM-3 治疗组的渗漏结果无差异。表明在激光损伤模型中,mPEG-SC20k-HM-3可以起到与阳性药Avastin相似的抑制作用。在细胞实验,我们发现mPEG-SC20k-HM-3治疗可以显著的抑制高糖培养条件下的人视网膜血管内皮细胞增殖和迁移。对分离获得的脉络膜样本和细胞样本进行分子生物学分析发现,与阳性对照组类似,mPEG-SC20k-HM-3治疗组中VEGF表达被显著抑制,同时,PI3K和HIF-1α表达量也显著下降。最后,对小鼠眼球玻璃体腔注射药物后的代谢分布来看,HM-3经修饰后的mPEG-SC20k-HM-3将原药物在血液中的半衰期延长了 14.66倍。第二部分实验中,我们发现黄芪甲苷单体可以减缓db/db小鼠图形视网膜电图的振幅的下降,降低活化的醛糖还原酶活性,降低DR视网膜组织中ERK1/2和NF-kB这两种因子的表达。因此推测,黄芪甲苷单体可以作为一种醛糖还原酶,通过抑制ERK1/2和NF-kB的活化而缓解db/db小鼠糖尿病视网膜损伤的进展。结论:在小鼠CNV模型中,mPEG-SC20k-HM-3药物在激光损伤后一周经玻璃体腔注射可以减少脉络膜的荧光素钠渗漏面积,从而间接抑制新生血管的生长。mPEG-SC20k-HM-3药物在作用于CNV小鼠眼部和高糖刺激的离体细胞后,组织中PI3K和HIF-1α的下调表达和VEGF的转录表达情况相一致,可以推断,PI3K和HIF-1α在新生血管的形成过程中起作用。在db/db小鼠模型中,黄芪甲苷单体可以通过抑制视网膜组织中醛糖还原酶活性来缓解糖尿病视网膜损伤的进展。从mPEG-SC20k-HM-3药物的代谢分布来看,因mPEG-SC20k-HM-3比未修饰的药物具有更长的药物半衰期,其较长的代谢时间可以减少玻璃体腔给药注射的频率,而黄芪甲苷单体是通过灌胃口服治疗糖尿病眼底病变的,从而减少了感染和眼球损伤等并发症的几率,具有不可替代的优势。因此新型多肽mPEG-SC20k-HM-3可能成为眼部新生血管性疾病中抑制CNV的有效药物,而黄芪甲苷单体也为眼底视网膜病变的治疗寻找到一个新的方向。