黑麦草、剪股颖再生体系的建立及农杆菌介导cry8C基因的导入

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多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera L.)是国内外广泛应用的重要冷季型草坪草之一,利用植物基因工程技术改良其抗虫性对防治地下害虫的危害,减少杀虫剂的使用,保护环境,节约草坪维护费用具有重要的意义。本文对这两种草坪草的组织培养与植株再生技术进行了研究。对于农杆菌介导的遗传转化技术进行了探索。经PCR方法检测,已获得转cry8C基因剪股颖。其主要研究内容如下: (1) 以多年生黑麦草卡特、畅想种子为外植体,卡特在2,4-D浓度为9mg/L时,愈伤诱导率最高达到41.3%;畅想在2,4-D浓度为7mg/L时,愈伤诱导率最高达到33.3%;在7mg/L 2,4-D时卡特胚性愈伤诱导率最高达到24.7%,畅想胚性愈伤诱导率最高达到18.7%。添加细胞分裂素TDZ对提高愈伤组织的诱导率有一定的作用,有助于改善愈伤组织状态。以黑麦草胚轴为外植体,其愈伤诱导率低于成熟种子的诱导率。添加脯氨酸和水解酪蛋白可以提高胚性愈伤诱导率。剪股颖南岸种子在6mg/L 2,4-D和0.2 mg/L TDZ培养基中诱导率最高达到68.1%,在5mg/L 2,4-D、0.1 mg/L TDZ时,胚性愈伤诱导率最高达到45.6%。 以继代2个月的胚性愈伤组织进行分化,在0.3mg/L TDZ、0.7mg/L 6-BA时黑麦草卡特的愈伤分化率最高达到31.7%;在0.5mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA时,畅想的分化率最高达到26%。剪股颖南岸在0.3mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA时,愈伤分化率最高达到52.7%。继代5个月后,卡特的愈伤分化率降到20.3%,畅想的愈伤分化率降到12.3%,南岸的愈伤分化率降到41.2%,作为遗传转化的受体材料,卡特和南岸的愈伤组织是比较合适的。 (2) 分别将抗虫基因cry8C置于Ubiquitin启动子和烟草根部特异启动子TobRB7的调控之下,构建成p30U8C和p30T8C两个可在植物中表达的载体,并将其导入根癌农杆菌LBA4404。通过农杆菌的介导将Ubiquitin/cry8C及TobRB7/Cry8C的结构导入两种草坪草,黑麦草卡特和剪股颖南岸。通过对转基因植株的PCR检测,已获得22株剪股颖阳性植株,阳性植株比例为51.2%。黑麦草卡特没有获得转基因植株。
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