目的：　　观察重组人血管内皮抑素联合放疗在乏氧条件下对结直肠癌细胞株HCT-116的放射敏感性；研究“时间窗”内应用重组人血管内皮抑素联合放疗对结直肠癌细胞株HCT-116裸鼠移植瘤的抑制作用及可能的作用机制；观察“时间窗”内使用重组人血管内皮抑素联合同步放化疗治疗局部进展期直肠癌患者的临床疗效和毒副反应，外周血VEGF、CECs及aCECs治疗前后的变化是否与重组人血管内皮抑素治疗疗效相关。　　方法：　　1. 体外细胞实验，在常氧和乏氧条件下培养结直肠癌细胞HCT-116，乏氧模型为在培养的细胞中加入终浓度为150μmol/L的CoCl2溶液形成细胞乏氧。　　①将培养的HCT-116细胞分为6组，分别加入终浓度为500mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、10mg/L、5mg/L、0mg/L的重组人血管内皮抑素，每组设3个附孔。用CCK-8法得到重组人血管内皮抑素对HCT-116细胞株在常氧和乏氧条件下的生长抑制率，根据所得数值绘制细胞生长曲线，HCT-116细胞在常氧和乏氧条件下的IC20通过细胞生长曲线得出。　　②将培养的HCT-116细胞分为4组，分别为常氧组、乏氧组、常氧加重组人血管内皮抑素组、乏氧加重组人血管内皮抑素组。加重组人血管内皮抑素组根据CCK-8实验确定的IC20值，常氧组加重组人血管内皮抑素的浓度为350mg/L，乏氧组加重组人血管内皮抑素的浓度为450mg/L。每组按照射剂量不同分为5个小组，放疗剂量分别为0、2、4、6、8Gy。用克隆形成实验检测重组人血管内皮抑素联合不同放疗剂量处理HCT-116细胞后在常氧和乏氧条件下的细胞存活分数，实验结果重复3次后取平均值，通过单击多靶模型拟合细胞存活曲线，得出各治疗组的平均致死剂量D0、准域剂量Dq、照射2Gy时的细胞存活率SF2和放射增敏比SER值。　　③取对数生长期的HCT-116细胞按每孔1x106个细胞接种于六孔板中，分为4个组，对照组、放疗组、重组人血管内皮抑素组、重组人血管内皮抑素联合放疗组。重组人血管内皮抑素组和联合组加入含重组人血管内皮抑素的培养液，放疗组和联合组采用6MV-X线照射，剂量为2Gy。用流式细胞术检测重组人血管内皮抑素联合放疗处理HCT-116细胞后在常氧和乏氧条件下细胞凋亡情况。　　2. 动物实验，取对数期生长的结直肠癌细胞HCT-116，用0.4%的台盼蓝计数，活细胞数>95%，用无血清McCoys5a培养基制成1×107个/200μl的细胞悬液。将细胞悬液200μl/只接种于40只裸鼠背部近头侧皮下，形成皮下移植瘤，待肿瘤长至308±56 mm3时，随机分成4组（每组10只）：对照组（连续10d每天瘤周皮下注射0.9%氯化钠溶液0.2ml）；重组人血管内皮抑素组（连续10d每天瘤周皮下注射0.2ml重组人血管内皮抑素（20mg/kg））；放疗组（连续10d每天瘤周皮下注射0.9%氯化钠溶液0.2ml；在治疗的第5天予单次外放疗，6MV-X线，6Gy）；联合组（连续10d每天瘤周皮下注射0.2ml重组人血管内皮抑素（20mg/kg）；在治疗的第5天予单次外放疗，6MV-X线，6Gy）。观察记录各组裸鼠肿瘤体积变化，裸鼠的精神、饮食状况以及体重变化。第16天，断颈处死裸鼠，将裸鼠背部的肿瘤组织完整剥出，用免疫组化法检测肿瘤组织中CD31、VEGF和HIF-1α的表达，Western Blot法从蛋白水平检测VEGF的表达。　　3. 临床试验，入组经免疫组化检测HIF-1α为阳性证实处于乏氧状态的ⅡB-ⅢC期的初治直肠癌患者50例，随机分为两组，联合组25例患者采用重组人血管内皮抑素联合同步放化疗（放疗采用IMRT：总剂量45-50Gy，单次剂量：1.8-2.0Gy，第5天开始，共5周；化疗采用单药卡培他滨：825mg/m2，每天2次，d5-18，d26-39；重组人血管内皮抑素：7.5mg/m2 d1-14，d22-35）；对照组25例患者采用同步放化疗，观察“时间窗”内应用重组人血管内皮抑素治疗后两组患者的疗效和毒副反应；并检测两组患者治疗前后血液VEGF、CECs和aCECs变化。　　结果：　　1. 体外实验　　①在常氧和乏氧培养下重组人血管内皮抑素均可以抑制HCT-116细胞的生长，表现为随着重组人血管内皮抑素浓度的升高及作用时间的延长，细胞生长抑制率升高，呈时间剂量依赖性，从细胞存活率曲线上获得常氧和乏氧条件下 IC20 分别为362.12±3.29mg/L和458.59±4.13mg/L。　　②在单击多靶模型中，在常氧条件下重组人血管内皮抑素处理HCT-116细胞后再行放疗放射敏感性无明显增加，两组肿瘤细胞的存活曲线差异不显著，单放组和重组人血管内皮抑素联合放疗组的D0和Dq值分别是1.412Gy、1.386Gy和1.333Gy、1.225Gy，重组人血管内皮抑素的SER值为1.02；在乏氧条件下重组人血管内皮抑素处理HCT-116细胞后再行放疗放射敏感性增加，两组的细胞存活曲线明显分开，单放组和重组人血管内皮抑素联合放疗组的D0和Dq值分别是1.721Gy、1.394Gy和2.514Gy、1.275Gy，重组人血管内皮抑素的SER值为1.23。　　③用流式细胞仪检测细胞凋亡显示，在常氧条件下，对照组、单放组、重组人血管内皮抑素组和联合组的凋亡率分别为18.3±0.49、46.8±0.32、20.1±0.43、47.2±0.34。联合组和单放组之间无统计学差异（F=1.31，P>0.05）；在乏氧条件下，四组的凋亡率分别为20.2±0.58、32.4±0.87、24.6±0.53、50.6±0.61，联合组和单放组之间有统计学差异（F=3.56，P<0.05）。　　2. 动物模型实验　　在整个实验过程中无裸鼠死亡情况发生，各组小鼠的饮食、行为、心理状态均无显著性差异，无明显全身不良反应及体重变化。治疗第16天各组的肿瘤体积分别为：对照组，V=2029.95±425.59mm3；重组人血管内皮抑素组，V=1781.75±412.53mm3；放疗组，V=1246.60±606.83mm3；联合组，V=453.35±181.43mm3。联合组与其他三组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。放疗组肿瘤体积较对照组明显缩小（t=3.34，P＜0.05）。重组人血管内皮抑素组与对照组间差异无统计学意义（t=1.32，P＞0.05）。各组的肿瘤重量（g）分别为：对照组，1.96±0.56；重组人血管内皮抑素组，1.78±0.45；放疗组，1.05±0.34；联合组，0.51±0.21。联合组与其他三组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。联合治疗组的肿瘤体积抑制率明显高于重组人血管内皮抑素组和放疗组（77.67%vs 12.31%，77.67%vs 38.59%，P<0.05）。免疫组化结果显示,各组VEGF阳性表达率为：对照组，30.12%±0.63%；重组人血管内皮抑素组，6.12%±0.18%；放疗组，40.05%±1.27%；联合组，12.30%±0.25%。放疗组与其他三组相比明显升高（P＜0.05），VEGF表达在重组人血管内皮抑素组和联合组明显低于对照组。重组人血管内皮抑素组的表达最低，与其他三组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。各组的MVD-CD31分别为：对照组，18.43±1.58；重组人血管内皮抑素组，9.05±1.46；放疗组，26.58±1.86；联合组，11.22±1.54。放疗组MVD-CD31明显高于其他三组（P＜0.05），而重组人血管内皮抑素组和联合组的MVD-CD31与对照组相比明显降低（P＜0.05）。各组HIF-1α阳性表达率分别为：对照组，66.34％±3.23%；重组人血管内皮抑素组， 16.43％±1.14％；放疗组，82.14％±3.65％；联合组，31.35％±1.51％。放疗组HIF-1α阳性表达率明显高于其他组（P<0.05），重组人血管内皮抑素组和联合组HIF-1α阳性表达率明显低于对照组，重组人血管内皮抑素组表达最低（P<0.05）。Western Blot结果也显示与对照组相比，放疗组的VEGF蛋白表达明显增高，而重组人血管内皮抑素组和联合组表达降低(P<0.05)。　　3. 临床试验　　50例乏氧的局部进展期直肠癌患者，近期疗效联合治疗组总有效率为（RCRG1+RCRG2）为92%，对照组总有效率为68%，两组差异具有统计学意义（χ2=4.50，P<0.05）；远期疗效联合组和对照组3年的OS率分别为91.7±1.8%，90.8±1.6%；DFS率分别为66.2±3.6%和63.8±5.8%；差异均无统计学差异（t=1.87，P>0.05；t=1.76，P>0.05）。两组的毒副反应主要为放射性肠炎和骨髓抑制，两组患者无明显差别（P>0.05），未见过敏、出血、心脏毒性反应。联合组治疗前血清VEGF浓度为（6.8±1.1)mg/L，治疗后血清VEGF浓度为（3.1±1.3)mg/L，差异有统计学意义（t=10.86，P<0.05）；对照组治疗前血清VEGF浓度为（6.6±1.3)mg/L，治疗后血清VEGF浓度为（5.9±1.4) mg/L，差异无统计学意义（t=1.83，P>0.05）。联合组治疗前外周血CECs平均数为（2308±158)个/ml，aCECs平均数为（798±88)个/ml；治疗后CECs平均数为（805±59) 个/ml，aCECs平均数为（126±14)个/ml，差异有统计学意义（t=44.56，P<0.05；t=37.71， P<0.05）；对照组治疗前外周血CECs平均数为（2296±162)个/ml，aCECs平均数为（786±84)个/ml；治疗后CECs平均数为（2352±149)个/ml，aCECs平均数为（749±85)个/ml，差异无统计学意义（t=1.27，P>0.05；t=1.55，P>0.05）。　　结论：　　1. 常氧培养下重组人血管内皮抑素对HCT-116细胞没有放射增敏作用，细胞凋亡率没有明显增加；乏氧培养下有放射增敏作用，细胞凋亡率明显增加。　　2. 在“时间窗”内重组人血管内皮抑素与放疗联合能够明显抑制HCT-116移植瘤的生长，可能的机制为抑制肿瘤血管新生和改善肿瘤细胞乏氧。　　3. 在“时间窗”内使用重组人血管内皮抑素联合同步放化疗治疗处于乏氧状态的局部进展期直肠癌，具有良好的近期疗效，但OS和DFS无明显延长；外周血VEGF、CECs及aCECs可以作为预测重组人血管内皮抑素治疗疗效的预测指标。