研究背景和目的炎症参与肿瘤发生发展的一个重要环节是通过肿瘤炎性微环境中关键炎性分子刺激肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭及诱导对化疗的耐药性而实现。流行病学和分子生物学研究表明炎症和CRC (CRC, colorectal cancer)发病之间存在着密切联系,即CRC是一种炎症相关性肿瘤。尽管炎症与CRC的关系已经基本明确,但是慢性炎症致瘤的具体分子机制十分复杂,炎症促进CRC发生发展的具体细节尚未阐明,例如炎性微环境中具有促癌作用的炎症因子的鉴定及其在CRC发生发展的作用和潜在的分子机制。这些问题的探讨将为阐明CRC的发生发展机制及寻找其新的干预靶点提供实验依据。S100A9是S100蛋白家族中与炎症相关的分子之一。早期的研究只发现S100A9的促炎作用,其机制主要通过促进中性粒细胞向炎症部位的聚集、粘附以及抑制中性粒细胞的程序性细胞死亡来实现。近年来,研究发现在一些肿瘤细胞和瘤周浸润的炎性细胞中其水平增高,提示其可能参与肿瘤的发生发展。那么,炎性分子S100A9是否参与CRC发生发展?基于此,本部分拟探讨炎性分子S100A9在CRC发生发展中的表达、作用及潜在的分子机制。旨在为炎症导致CRC的发生发展机制的阐明提供实验依据,也可能为CRC的预防和治疗提供候选的干预靶点。实验方法1人CRC组织及细胞中S100A9的表达检测1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学技术(IHC)和蛋白印迹法(Western blot)检测CRC组织及癌周正常组织样本(n=42)中S100A9基因及蛋白的表达。2) Western blot检测CRC细胞系(HCT116、SW480及LoVo)及正常肠黏膜上皮细胞系(NCM460)中S100A9的表达。2干预工具构建与制备1)重组腺病毒AdS100A9的扩增和验证：通过携带人S100A9基因的重组腺病毒AdS100A9及对照腺病毒AdGFP感染人胚肾HEK293细胞将其扩增；AdS100A9及AdGFP感染CRC细胞系HCT116与SW480,提取细胞总蛋白后通过Western blot方法检测不同处理组S100A9的表达,验证AdS100A9感染的有效性。2)重组蛋白GST-S100A9的制备：将pGST-moluc-S100A9和pGST-moluc转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达；经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)从超声破菌后收集的菌液中分离纯化GST-S100A9和GST蛋白,通过滤器除菌后分装,并保存在-80℃备用。3 S100A9对CRC细胞增殖及迁移的影响采用MTT法及平板克隆形成试验检测AdS100A9和GST-S100A9分别处理CRC细胞系后细胞增殖能力的改变,采用Transwell迁移试验检测分析AdS100A9和GST-S100A9分别处理CRC细胞系后迁移能力的变化。4 S100A9促进CRC细胞增殖和迁移的分子机制1)探讨S1009与RAGE的关系：免疫组织化学(IHC、Western blot及细胞免疫荧光技术检测RAGE在CRC组织及细胞中的表达；GST-pull down、免疫共沉淀、免疫荧光双标分析S 100A9与RAGE相互作用。2)探讨S100A9与β-catenin的关系：Western blot检测β-catenin与GSK3β磷酸化水平表达,细胞免疫荧光及免疫细胞化学法(ICC)分析β-catenin分布,RT-PCR检测β-catenin、c-myc、MMP7及Cyclin D转录水平变化。3)探讨S100A9、RAGE及β-catenin之间的关系：Western blot法检测β-catenin> p38/p-p38 MAPK及p-AKT/AKT水平及其变化。实验结果1 CRC组织及细胞中S100A9的表达1)癌组织中S1000A9基因转录水平及蛋白水平显著高于癌周正常组织；三株CRC细胞系HCT116, SW480和LoVo中S100A9的表达显著高于正常肠上皮细胞系NCM460。癌组织样本中S100A9阳性率(69.1%,29/42)也明显高于癌周正常组织(16.7%,7/42)(P<0.001)。2)癌组织中S100A9的表达与肿瘤分化(p<0.05)、Dukes分期(p<0.01)及淋巴结转移(p<0.01)呈正相关,而与性别、年龄、肿瘤大小无关。提示S100A9可能参与CRC的发展,并可望作为CRC分期、是否发生淋巴转移和预后分析等的标志物。2 S100A9对CRC细胞增殖及迁移的影响1) AdS100A9及其对照AdGFP处理CRC细胞至指定的实验处理时间：与对照AdGFP相比,AdS100A9处理后HCT116与SW480细胞的增殖和迁移能力均无明显变化。2) GST-S100A9及对照GST蛋白处理HCT1 16及SW480细胞至指定的实验处理时间：与GST相比,GST-S100A9在10 gg/ml及20μg/ml浓度条件下均能促进细胞增殖(P<0.05),以10μg/ml GST-S100A9时促进作用更显著。基于此,本论文后续全部实验应用GST-S100A9蛋白处理细胞的浓度均为10 μg/ml。此外,GST-S100A9也促进CRC细胞HCT116及SW480的克隆形成(P<0.01)及迁移(P<0.05)。以上结果提示S 100A9可能主要是通过分泌到胞外,再通过细胞膜上受体将相关信号转入胞内,从而实现其促进CRC细胞增殖及迁移的作用。3 S100A9促进CRC细胞增殖及迁移的分子机制1)S100A9与RAGE关系：与正常组织和肠上皮细胞相比,RAGE在CRC组织及细胞系中表达明显更高；CRC组织中S100A9与RAGE的分布有共定位现象,同时体外实验进一步证实S100A9可以与RAGE结合；采用RAGE中和抗体处理细胞后,S100A9促CRC细胞增殖及迁移的效应均被部分阻断(P<0.05)。以上提示胞外S100A9可以通过与RAGE结合,从而促进CRC细胞的增殖及迁移。2)S100A9与P-catenin的关系：GST-S100A9处理CRC细胞后,引起Wnt/β-catenin信号通路相关分子的变化,包括：(1)大量β-catenin在胞浆聚集并转入核中；(2)β-catenin基因在转录水平无明显变化,但该通路的下游关键靶基因c-myc、MMP7和Cyclin D的转录水平则显著增加；(3)GST3β磷酸化水平增高；(4)当用Adsiβ-catenin感染CRC细胞、降低Wnt/β-catenin信号的活性后,S100A9蛋白促CRC细胞增殖及迁移效应均被部分阻断(P<0.05)。以上结果提示胞外S100A9蛋白可以通过超活化Wnt/β-catenin信号促进CRC细胞增殖及迁移。2) S100A9、RAGE及β-catenin三者之间的关系：(1) GST-S100A9致β-catenin及p-GSK3β水平增加能够被RAGE中和抗体所阻断,提示S100A9诱导的Wnt/β-catenin信号通路的超活化与RAGE有关；(2)GST-S100A9处理CRC细胞后p38 MAPK及AKT磷酸化水平增高,且该效应能够被RAGE中和抗体所阻断,提示p38 MAPK及AKT是RAGE的下游靶分子；(3)Akt特异性抑制剂(LY294002)能有效抑制GST-S100A9诱导的β-catenin水平增加,而p38特异抑制剂(SB203580)处理细胞后,对GST-S100A9诱导的P-catenin水平增加无影响,提示Akt的活化参与介导GST-S100A9诱导的Wnt/β-catenin信号的超活化。结论1) CRC中的S100A9表达增加,并与其临床肿瘤分化、Dukes分期及淋巴结转移相关。2) 胞内S100A9对CRC细胞增殖及迁移无明显影响,而胞外微环境中的S100A9可以促进CRC细胞的增殖及迁移。3) 胞外微环境中的S100A9促CRC细胞增殖及迁移的效应与RAGE/AKT/β-catenin信号通路的激活有关。研究背景和目的S100A6蛋白是S100蛋白家族中的一员,已被证实其在多种肿瘤包括CRC中高表达。最近有研究表明S100A6的表达与CRC的分期及淋巴转移有关。那么S100A6是否参与CRC进展,目前尚不清楚。因此,本课题主要研究S100A6在CRC组织及细胞系中的表达,探索其对CRC细胞生物学作用及潜在的分子机制。本研究为CRC发生发展机制的阐明提供实验依据,也可为CRC的治疗提供候选的干预靶点。实验方法1人CRC组织及细胞系中S100A6的表达1)通过免疫组织化学技术(IHC)及蛋白印迹法(Western blot)检测CRC组织及癌周正常组织样本中S100A6表达及分布,比较癌组织及癌周正常组织中S100A6表达差异。2)通过细胞免疫荧光方法及Western blot法检测CRC细胞系(HCT116、SW480及LoVo)及正常肠黏膜上皮细胞系(NCM460)中S100A6的表达,比较癌细胞系及正常细胞系中S100A6表达差异。2干预工具构建与制备1)重组腺病毒AdS 100A6与AdsiS100A6的扩增和验证：将携带人S100A6基因的重组腺病毒AdS100A6及携带S100A6-siRNA gene片段的重组腺病毒AdsiS100A6感染人胚肾HEK293细胞,进行病毒扩增；扩增的AdS100A6及AdsiS100A6分别感染CRC细胞系HCT116与LoVo,通过Western blot方法检测S100A6表达,验证AdS100A6及AdsiS100A6感染的有效性。2)重组蛋白S100A6的制备将质粒pGST-Moluc-HRV3C-S 100A6及pGST-Moluc-HRV3C分别转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)诱导GST-HRV3C-S100A6及pGST-Moluc-HRV3C蛋白表达；然后在冰上超声破菌,离心收集菌液。通过谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)与菌液孵育,结合GST-HRV3C-S100A6及pGST-Moluc-HRV3C蛋白,并通过洗液将其洗脱下来。利用GST-HRV3C蛋白酶消化GST-HRV3C-S100A6,酶切下来多余的GST标签及GST-HRV3C被谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠结合去除。最终,S100A6蛋白通过滤器除菌后保存在-80℃备用。3 S100A6对CRC细胞增殖及迁移的影响AdS100A6、AdsiS100A6及S100A6蛋白处理CRC细胞后,采用MTT试验检测细胞增殖能力,Transwell迁移试验及划痕愈合试验检测细胞迁移能力。4 S100A6介导CRC细胞增殖及迁移的分子机制1)S100A6对MAPK信号活性的影响：Western blot方法检测p38/p-p38、ERK1/2/p-ERK1/2及JNK/p-JNK表达。2)通过p38及ERK1/2特异性抑制剂处理CRC细胞后分析S100A6介导的细胞增殖及迁移能力的变化。实验结果1CRC组织及细胞系中S100A6的表达癌组织中S1000A6表达显著高于癌周正常组织；三株CRC细胞系HCT116、SW480及LoVo中,S100A6的表达显著高于正常肠上皮细胞系NCM460。2 S100A6对CRC细胞增殖及迁移的影响。用AdS100A6处理CRC细胞HCT1 16(内源性S100A6相对低表达),而AdsiS100A6处理CRC细胞LoVo(内源性S100A6相对高表达),处理至预定的时间：与AdGFP相比,AdS100A6处理后细胞增殖能力及迁移能力均增强(P<0.05)；与AdRFP相比,AdsiS100A6处理后细胞增殖能力及迁移能力均减弱(P<0.05)。此外,S100A6蛋白(0,5,10及20 μg/m1)处理HCT116至指定的处理时间：S100A6在5,10及20μg/ml浓度条件下均能促进细胞增殖及迁移,且S100A6在20μg/ml处理时促进作用更显著(P<0.001)。基于此,后续实验处理细胞的S100A6蛋白浓度为20μg/ml。以上结果提示S100A6可以促进CRC细胞的增殖及迁移。3 S100A6介导CRC细胞增殖和迁移的潜在分子机制1)S100A6对MAPK信号活化的影响：与AdGFP相比,AdS100A6处理HCT116细胞后p-p38及p-ERK1/2水平增高(P<0.01),而p-JNK水平无明显变化；与AdRFP相比,AdsiS100A6处理LoVo细胞后p-p38及p-ERK1/2水平均降低(P<0.01),而p-JNK水平无明显变化。2)p38及pERK1/2 MAPKs活化对S100A6促CRC细胞增殖及迁移的作用：当用p38抑制剂SB203580或ERK1/2抑制剂PD98059有效抑制该信号通路后,AdS100A6或S100A6蛋白促HCT116细胞增殖的作用被PD98059部分逆转(P<0.05),AdS100A6或S100A6蛋白促HCT116细胞迁移作用被SB203580部分逆转(P<0.05)。上述结果提示：MAPK信号通路中ERK1/2的激活参与介导S100A6促CRC细胞增殖,而MAPK信号通路中p38的激活参与介导S100A6促CRC细胞迁移。结论直肠癌中存在S100A6异常高表达。S100A6可以促进CRC细胞增殖及迁移,其机制分别与激活ERK1/2及p38 MAPKs信号通路有关。