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骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病,多发于老年人群,以女性多见,严重影响患者的生活质量,消耗大量的个人及社会财力。目前,OA的治疗包括传统的药物治疗和外科手段,疗效有限,无法阻止OA的进一步发展。近年来,应用组织工程技术,通过组织和／或细胞移植来获得更多的接近于正常的透明软骨,从而达到软骨修复的目的。但是,由于组织和种子细胞的来源有限,限制了该项技术进一步发展,尤其对缺损较为严重软骨组织。基因转染为组织工程的发展开辟了新的途径,将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期保持局部较高的治疗浓度,从而达到治疗目的。目前已有许多研究表明基因治疗对OA的有效性,并且多基因联合治疗OA效果好于单基因。关节软骨的结构和功能依赖于其合成代谢与分解代谢的相互作用和平衡,一方面,合成代谢中的生长因子以转化生长因子-β(TGF-β)家族为主,另一方面,分解代谢中的炎性因子以白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为主。在临床应用之前,我们有必要在细胞实验和动物实验中确证哪些功能基因或基因的组合会对OA产生更好的治疗效果。本实验,以逆转录病毒为载体将重组人IL-1Ra(分解代谢因子IL-1受体拮抗蛋白)和TGF-β1(合成代谢重要因子)基因转染至正常的软骨细胞及OA的软骨细胞,观察其对软骨细胞增殖的影响；另外我们将基因直接注射到兔膝骨关节炎动物模型的关节内,从促进软骨细胞及基质合成和抑制软骨细胞及基质分解两个层面来研究治疗OA的疗效。第一部分联合基因转染兔膝正常软骨细胞及OA软骨细胞对其增殖代谢的影响目的：观察以逆转录病毒为载体,介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)基因与转化生长因子-p1(TGF-β1)基因共转染兔膝关节正常及OA软骨细胞后,观察IL-1Ra及TGF-β1基因含量的表达,及对正常及OA软骨细胞增殖代谢的影响。方法：将体外培养的正常及OA软骨细胞分别分为空白转染组、空载体转染组、IL-1Ra单基因转染组、TGF-β1单基因转染组及IL-1Ra和TGF-β1双基因转染组。用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对其分别进行瞬时基因表达(基因转染后48h)。结果：基因转染48h后,正常软骨细胞及OA软骨细胞空白组与PLNCX2空载体转染组的上述指标差异无显著性(P>0.05)；基因转染组有明显基因表达,与空白组及PLNCX2空载体转染组相比(P<0.05),双基因转染组较单基因转染组IL-1Ra、TGF-β1含量均明显提高(P<0.01)。IL-1Ra单基因转染时在正常软骨细胞与OA软骨细胞比较IL-1Ra含量差异无显著性(P>0.05),与TGF-β1双基因转染时在正常软骨细胞与OA软骨细胞IL-1Ra含量比较差异有显著性(P<0.05)；TGF-β1单基因转染和双基因转染时在正常软骨细胞与OA软骨细胞中TGF-β1含量比较差异无显著性(P>0.05)。结论：基因转染正常软骨细胞及OA软骨细胞后可获得稳定表达,IL-1Ra+TGF-β1双基因转染的软骨细胞生物学活性优于两者中的任一单基因转染,为基因治疗骨关节炎的研究提供实验基础。OA软骨细胞较正常软骨细胞生物学活性较弱,对IL-1Ra、TGF-β1单基因和双基因转染反应性能不如正常软骨细胞强。第二部分关节腔内注射逆转录病毒载体介导的重组人IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔膝骨关节炎的研究目的：观察膝关节内注射逆转录病毒介导的白细胞介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)与转化生长因子-p1(TGF-β1)基因在关节中的表达及对OA的治疗效果。方法：用前交叉韧带切断法(ACLT)制造新西兰白兔膝OA模型,共30只,随机分为5组,Ⅰ组为空白对照组(未行ACLT处理),Ⅱ组为手术对照组,Ⅲ组为IL-1Ra转染组,Ⅳ组为TGF-β1转染组,V组为IL-1Ra和TGF-β1双基因转染组。外源基因注射后4周和8周,用PBS灌洗兔膝关节,获取关节液ELISA分析转基因表达,取关节标本进行Mankin’s评分,阿尔辛蓝-过碘酸雪夫试剂(AB-PAS)染色,TGF-β1、IL-1Ra及Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化检测。结果：在基因注射后4周和8周,空白对照组的大体评分和Mankin’s评分明显低于手术对照组差异有显著性(P<0.01),手术对照组的大体评分和Mankin’s评分高于单基因转染组和双基因转染组差异有显著性(P<0.05),基因治疗8周与4周比较,各对应组评分普遍提高,但差异无显著性意义(P>0.05)。关节液ELISA分析显示空白对照组和手术对照组比较各因子含量无明显差别差异无显著性(P>0.05),与单基因转染组和双基因转染组比较TGF-β1、IL-1Ra含量明显增高差异有显著性(P<0.05)；单基因转染组与双基因转染组比较,4周时双基因转染组各因子含量明显高于单基因转染组差异有显著性(P<0.05),而8周时双基因转染组各因子含量略高于单基因转染组差异无显著性(P>0.05),8周与4周比较各基因含量有所减少,差异有显著性(P<0.05)。各基因转染组原位杂交和免疫组织化学染色较空白对照组和手术对照组深,灰度值比较差异有明显差异(P<0.01),单基因转染组与双基因转染组灰度值比较差异有明显差异(P<0.01),基因治疗8周后,各对应组染色阳性细胞较4周时减少,除空白对照组与手术对照组外,各组灰度值与4周时比较均有差异有显著性差异(P<0.05),8周时基因表达有所减弱。结论：以逆转录病毒为载体介导基因转入兔膝骨关节炎关节腔内,可获得稳定的外源基因表达,TGF-β1和IL-1Ra可有效阻止OA的进一步发展,双基因转染效果优于单基因转染,且外源基因表达具有时效性。