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背景邻苯二甲酸酯类(Phthalates,PAEs)是一种全球最普遍的环境激素类污染物,目前,在大气飘尘、工业废水、河流和土壤、固体废弃物中、食品和饮用水都能检测到PAEs,在成人的尿液、血液、羊水中也能检测出PAEs,甚至新生儿的尿液中也发现了它们的存在。流行病学研究显示,PAEs作为公认的环境内分泌干扰物,与生殖健康关系密切。妇女孕期接触邻苯二甲酸酯类化合物,所产男婴患隐睾、尿道下裂、成年期睾丸肿瘤及精液质量低下等的几率明显增加。邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)是PAEs中常用物质之一,主要作为增塑剂及日化用品的添加剂,在环境中广泛存在。雄性生殖发育毒性是DBP的主要毒性作用,表现为染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂。睾丸支持细胞是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的结构支持和营养物质,参与精子发生及其调控。睾丸支持细胞功能的紊乱可导致精子发生障碍及生精细胞的缺失。DBP作用于雄性大鼠后,睾丸支持细胞相关蛋白表达异常,改变了睾丸支持细胞的结构和功能,导致生精小管结构及功能的变化,以致生精功能障碍。目前,虽然DBP对睾丸支持细胞的损伤作用已明确,但因其作用机制十分复杂,其确切的损伤机制还不十分清楚。直至目前,仍未发现DBP对睾丸支持细胞损伤的特异性标志物。因此,研究睾丸支持细胞的损伤机制,筛选DBP损伤睾丸支持细胞的特异生物标记物,为监测DBP对睾丸支持细胞的损伤作用以及针对其损伤机理制定有效的预防措施提供依据。目的采用比较蛋白质组学的方法分析DBP作用于睾丸支持细胞后蛋白质表达谱的变化,初步对差异蛋白的功能进行分析,以期从蛋白水平上揭示DBP损伤睾丸支持细胞的机制,进而发现可能成为DBP损伤睾丸支持细胞特异生物标记物的蛋白。方法1.体外分离、纯化、培养和鉴定大鼠睾丸支持细胞:取18~21日龄雄性SD大鼠的睾丸组织,体外原代培养睾丸支持细胞,苔盼蓝鉴定细胞活力,油红O鉴定细胞纯度。2.建立大鼠睾丸支持细胞DBP损伤的细胞模型:应用不同浓度的DBP作用于原代培养的大鼠睾丸支持细胞,采用DMSO作为对照组。3.使用光镜及电镜观察DBP作用后大鼠睾丸支持细胞的形态学变化。4.蛋白质组学方法筛选差异表达的蛋白:提取睾丸支持细胞总蛋白,采用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定差异蛋白。5.Western blot方法对蛋白组学方法筛选出的部分差异表达蛋白进行鉴定。结果1.DBP作用后细胞形态学变化:与对照组比较,光镜下见睾丸支持细胞数量减少,细胞形态发生变化;电镜下见睾丸支持细胞超微结构发生改变。2.应用蛋白组学方法共鉴定出7种差异表达的蛋白,与对照组相比,着丝粒蛋白-1、Myl6蛋白、过氧化物酶-5、细胞分裂蛋白激酶-16亚体b、Myl9蛋白、(肌动蛋白)抑制蛋白表达均上调,磷酯酰乙胺醇连接蛋白-1表达下调。4.用Western blot方法对过氧化物酶-5、磷酯酰乙胺醇连接蛋白-1进行验证,过氧化物酶-5表达下调,磷酯酰乙胺醇连接蛋白-1表达上调,Western blot检测结果与双向电泳结果一致。结论1.DBP损伤大鼠睾丸支持细胞导致其形态结构发生改变,DBP对大鼠睾丸支持细胞具有毒性作用。2.本次实验成功建立了染毒大鼠睾丸支持细胞比较蛋白质组学研究方法,发现了七种存在差异表达的蛋白质,其中,着丝粒蛋白、过氧化物酶-5、磷酯酰乙胺醇连接蛋白-1、抑制蛋白与DBP的雄性生殖发育毒性机制有关,其损伤机制可能是:⑴抑制细胞发育及增殖,诱导细胞凋亡;⑵使波形蛋白及微管蛋白的表达异常,破坏细胞骨架,致使生精细胞凋亡增加。3.着丝粒蛋白可能成为DBP损伤睾丸支持细胞的特异生物标记物。