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转基因标识制度的建立要求对转基因植物及其产品进行快速准确的检测。转基因水稻B2A68是本课题组利用农杆菌介导法转化籼稻恢复系D68得到的抗虫、抗除草剂水稻恢复系。本文以转基因水稻B2A68为实验材料,扩增获得其外源DNA片段插入位点的旁侧序列,并以此为基础建立了转基因水稻B2A68转化事件特异性检测方法,同时对该转基因水稻的蛋白表达量、抗虫和抗除草剂特性以及农艺性状等方面进行了测定。论文主要内容及结论如下:
1.利用hiTAIL-PCR方法及LD-PCR方法扩增获得转基因水稻B2A68中T-DNA右边界1975 bp的右旁侧序列,该序列位于水稻第3染色体上,包含120 bp的载体序列和1855bp的水稻基因组序列。参考已公布的该插入位点的水稻基因组序列和载体左边界序列分别设计游引物,扩增获得外源基因插入位点的左边界2856 bp旁侧序列。以左右旁侧序列为基础,建立了转基因水稻B2A68事件特异性定性检测方法。该方法检测灵敏度为0.1%,能满足海关、工商、农业等部门的检测需求。
2.采用ELISA方法分析转基因水稻B2A68中杀虫蛋白Cry2Aa表达量的时空变化规律,结果表明:杀虫蛋白在不同基因型植株叶片中表达量差异明显,表现为纯合植株叶片中蛋白表达量显著高于杂合植株;成熟期不同组织中蛋白表达量高低顺序为叶片>谷粒>茎秆>根;整个生育期叶片和茎秆中蛋白表达量的高低顺序为苗期>分蘖期>成熟期>齐穗期,而根中表达规律为分蘖期>齐穗期>成熟期>苗期。
3.连续2代(T3代和T4代)目的基因(Cry2Aa#、Bar)PCR检测显示转入水稻中的外源基因能稳定遗传。利用外源片段插入位点边界序列设计的引物进行PCR检测可以当代区分出外源基因的纯合态和杂合态。纯合植株在下一代中外源基因没有分离,而杂合植株在下一代出现外源基因分离。
4.抗虫、抗除草剂试验结果显示转基因水稻B2A68对稻纵卷叶螟和草铵膦具有明显抗性。