前言：阿尔茨海默病(Alzhcimers disease,AD)是一种以进行性痴呆为主要特征的神经退行性疾病,其主要临床表现为进行性记忆力减退、认知功能下降和严重的精神障碍。老年斑(senile plaque,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和神经元缺失为其主要病理特征。　　 SP主要出现在大脑皮质和海马区域,其核心成分是一种由39～43个氨基酸残基构成的小神经肽Aβ(amyloid beta peptide,Aβ),Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursor protein,APP)等经过β-分泌酶及γ-分泌酶水解产生并分泌至细胞外。在正常生理状态下,人脑内存在极少量(纳摩尔级浓度)的可溶性Aβ,对神经元具有神经营养作用。但在AD时,APP经过异常剪切加工形成大量Aβ,且Aβ从可溶状态转变为不溶状态,最终在脑部形成淀粉样沉积,是AD发病机制中的关键环节。　　 Tau蛋白是一种微管相关蛋白,能与成熟神经元的微管结合,起到促进微管形成和稳定微管结构的作用。Tau蛋白磷酸化对其与微管的结合至关重要。然而,异常的tau蛋白聚合成双股螺旋丝(paried helical filaments,PHFs),不利于其与微管结合,并导致微管网络不稳定和神经元死亡。NFTs的形成与tau蛋白过度磷酸化密切相关,且NFTs的数量与患者的痴呆程度呈正相关。蛋白激酶(如GSK3、CDK5和MAPK)在tau蛋白磷酸化过程中起重要作用。　　 丙戊酸钠(valproate,VPA)是一种广泛用于治疗癫痫和情感障碍的抗惊厥药物和情绪稳定剂。最近的研究显示,VPA也是一种预防和治疗AD的潜在药物。VPA通过抑制GSK3β介导的APP的γ-位点剪切减少了AD转基因小鼠Aβ产生和SP的形成,改善学习记忆损伤。但是,VPA是否影响tau蛋白磷酸化及其潜在的机制尚不清楚。　　 本研究首先给予APP/PS1转基因小鼠VPA治疗后,检测SP形成、Aβ分泌情况、APP的代谢和对tau蛋白磷酸化过程的作用途径及作用效果,进而探讨VPA对AD小鼠脑组织SP和NlFTs形成的影响,为探讨AD的发病机制、寻找治疗AD的有效药物提供理论依据。此外,本研究通过检测VPA对冈田酸(okadaic acid,OA)刺激引起的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响及相关蛋白激酶的变化,进一步在细胞水平探讨VPA在AD中的神经保护作用及其机制。　　 实验材料和方法APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)转基因小鼠购自美国Jackson实验室,通过常规喂养(22-25℃,50％湿度,12h光照循环),繁殖后经PCR进行基因型鉴定,鉴定后的小鼠用于实验。将20周龄的APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和VPA治疗组。VPA治疗组小鼠腹腔注射VPA(50mg/kg),每日1次,对照组小鼠给予等量的生理盐水。12周后,小鼠经麻醉处死取材,脑组织两侧半球分开,右侧脑组织于4％多聚甲醛中固定后石蜡包埋,用于免疫组化分析,左侧脑组织-80℃低温冷冻保存,用于生化检测、免疫印迹、ELISA分析等。　　 对OA处理的SH-SY5Y细胞,给予VPA作用24h,然后应用免疫荧光和免疫印迹等方法检测tau蛋白磷酸化及其相关信号通路蛋白的变化。　　 结果：　　 一、VPA对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ老年斑形成的影响　　 1、VPA减少APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积和SP形成应用免疫组化技术观察各组小鼠脑内SP的数量及大小,结果表明VPA治疗组小鼠的大脑皮层及海马等区域出现的阳性SP数目与对照组相比分别显著减少60％,斑块沉积也分别由0.55％降到0.26％、0.50％降到0.19％,差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。ELISA结果显示,VPA治疗组小鼠脑内可溶性Aβ的水平由89pg/mg降到77pg/mg,具有统计学意义。　　 2、VPA对APP/PS1转基因小鼠脑内APP裂解酶蛋白表达的影响Western blot结果分析表明,与对照组相比,VPA治疗组APP695在蛋白水平没有明显变化(P＞0.05)。然后我们检测了APP裂解酶的蛋白变化,统计分析表明,与对照组相比,VPA治疗组转基因小鼠脑内APP裂解酶BACE1表达明显减少11％(P＜0.05),而ADAM10和PS1的蛋白表达两组比较没有明显差异(P＞0.05)。　　 二、VPA对tau蛋白磷酸化的影响　　 (一)VPA对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响　　 1、VPA抑制APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化应用Western blot检测APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白的几个重要磷酸化位点(Thr205、Thr231和Ser396)的磷酸化水平,结果显示:在两组实验小鼠脑内总tau蛋白表达无显著差异的情况下,VPA治疗组小鼠脑内tau蛋白的磷酸化程度明显低于对照组,降低幅度分别为65％(Thr205,P＜0.01),57％(Ser396,P＜0.01)和54％(Thr231,P＜0.05)。提示VPA抑制了APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白的磷酸化。　　 2、VPA抑制APP/PS1转基因小鼠脑内CDK5和GSK3β的活性用Western blot检测CDK5和GSK3磷酸化水平。与对照组相比,VPA没有明显影响APP/PS1转基因小鼠脑内CDK5的蛋白水平,但显著降低了p-CDK5(Tyr15)的水平。定量分析表明VPA治疗组小鼠脑内的p-CDK5/CDK5比值较对照组降低了34％(P＜0.05)。此外,VPA治疗组转基因小鼠脑内p-GSK3β(Ser9)的表达水平明显升高且p-GSK3β/GSK3β比值增加了39％(P＜0.05)。但是,p-GSK3α/GSK3α比值未见明显的变化(P＞0.05)。这些数据表明,VPA治疗明显抑制了APP/PS1转基因小鼠脑内CDK5和GSK313的活性。　　 3、VPA对APP/PS1转基因小鼠脑内p35/25蛋白表达的影响由于CDK5的激活需要p35的存在,p35裂解为p25可以持续激活CDK5,因此,我们进一步采用Western blot检测了p35/25的蛋白表达。结果显示p35的蛋白表达没有明显变化(P＞0.05),但未检测到p25的蛋白表达。　　 (二)VPA对OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响　　 1、VPA抑制OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化为了进一步在体外探讨VPA对tau蛋白磷酸化的影响,我们用OA处理SH-SY5Y细胞以诱导tau蛋白磷酸化,然后给予VPA作用24h,观察VPA对培养细胞的tau蛋白磷酸化水平的影响。定量分析表明,与对照组相比,VPA处理组与对照组细胞总tau蛋白的含量没有明显变化,而VPA处理组细胞的tau磷酸化水平分别降低40％(Thr205,P＜0.05),27％(Ser396,P＜0.01)和16％(Thr231,P＜0.05)。此外,免疫荧光染色激光共聚焦扫描显微镜分析显示,VPA处理降低了磷酸化tau蛋白Thr231的荧光强度。上述结果表明,VPA能抑制OA处理的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化。　　 2、VPA抑制OA处理的SH-SY5Y细胞CDK5和GSK313的活性激光共聚焦扫描显微镜分析结果显示,p-CDK5免疫荧光强度在VPA处理的细胞中明显降低。Western blot结果表明,与对照组相比,VPA处理组p-CDK5/CDK5的比值显著降低了38％。此外,与OA处理的对照组细胞相比,VPA处理组细胞p-GSK3β/GSK3β的比值显著增加了48％。　　 CDK5的磷酸化水平与其活性成正相关,而GSK3β的磷酸化水平与其活性成负相关。因此,以上数据表明,VPA能抑制OA处理的SH-SY5Y细胞CDK5和GSK3β的活性。　　 3、VPA对OA处理的SH-SY5Y细胞p35/25蛋白表达的影响激光共聚焦扫描显微镜分析结果表明,VPA减少了p35/25免疫荧光强度(抗体可以识别p35和p25),且同时伴有磷酸化tau蛋白(Thr231)免疫荧光强度的减弱。Western blot结果显示,VPA处理并未改变OA处理的细胞中p35蛋白的表达水平,而p25/p35的比值显著下降,与对照组相比,VPA处理使p25/p35的比值下降了28％(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、VPA处理可以减少APP/PS1转基因小鼠脑内SP的形成和β-分泌酶的蛋白表达水平,抑制APP的淀粉样蛋白途径；　　 2、VPA处理可以抑制APP/PS1转基因小鼠脑内及OA处理的SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化；　　 3、VPA通过抑制CDK5和GSK3的活性减少tau蛋白的磷酸化；　　 4、VPA可能通过CDK5/p25途径参与对tau蛋白磷酸化的抑制。