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目的 成纤维细胞生长因子(FGFs)家族至少包括20种生长因子或癌基因的产物,它们具有促分裂、促分化作用。FGFs能促进血管生成,参与伤口愈合、组织修复、神经组织生长和再生、动脉粥样硬化的斑块形成等许多病理生理过程,在肿瘤的发生、发展和转移过程中也起着重要作用。近年来,人们最感兴趣的是该家族中的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。bFGF与其高亲和力受体结合,FGF受体二聚化,受体胞内段酪氨酸激酶活性区发生自身磷酸化激活,进而使细胞浆与细胞核内一系列靶蛋白磷酸化或去磷酸化,从而发挥调节细胞功能的作用。 FGFs可以通过多条信号转导通路发挥调节细胞功能的作用,如PLC/PKC,RTK/RAS/MAPK,JAK/STAT,PI3K/PKB等途径。蛋白激酶B(PKB)是近年来发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的下游底物。PI3K/PKB通路主要通过生长因子如EGF、PDGF、VEGF、IGF-1等与受体结合而激活。活化的PI3K产生PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(3,4)P2,二者与PKB的PH结构域结合,使之转位到细胞膜,在磷脂酰肌醇依赖性激酶1(PDK1)和磷脂酰肌醇依赖性激酶2(PDK2)作用下,PKB的Thr308和Ser473分别磷酸化,从而使PKB活化。活化的PKB可以使多种底物磷酸化,从而调节糖代谢与转运、基因转录、蛋白质的合成和细胞凋亡等重要生理过程。PKB在原发性胃腺癌、前列腺、卵巢和乳腺肿瘤中过表达,PKB的过表达与卵巢癌病人的预后不良和生存率下降有关。 周期蛋白-CDK复合物是调节细胞周期进程的重要因素,处于细胞周期检查点上。不同的周期蛋白在细胞周期的不同时期表达,且与不同的CDK结合。进而周期蛋白-CDK复合物表现出活性,调节细胞周期进程。卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。然而,有关bFGF通过PI3K/PKB信号转导途径在卵巢癌发生中所发挥的作用尚缺乏系统的认识。在本研究中,通过采用外源性bFGF作用于人卵巢癌细胞系CAOV3,检测其对PKB活性及细胞周期蛋白D表达的影响,从而探讨bFGF通过PI3K/PKB信号转导途径调控卵巢癌细胞生长增殖的信号转导机制。实验材料与方法 1.细胞培养:人卵巢癌细胞系CAOv3细胞在含10%小牛血清的RPM 1 640培养基,37℃,5%COZ条件下培养,取对数生长期细胞进行随机分组。 2.利用特异性识别磷酸化PKB(Sex473)抗体进行Weste。印迹杂交,检测不同浓度bFGF处理相同时间及是否采用P13K特异性抑制剂Wort-min预处理后,相同浓度bFGF孵育不同时间点卵巢癌细胞PKB的活性。 3.特异性cyclinD抗体进行Western印迹杂交,检测相同浓度bFGF处理不同时间及是否采用Wortmannin预处理后bFGF对卵巢癌细胞cyclinD的表达的影响。 4.统计学分析:用SPSSll .5软件统计包进行统计学分析(P<0.05为显著性差异标准)。结果 1.bFGF对人卵巢癌细胞系CAOV3的PKB活性的影响:采取不同浓度的bFGF与CAOV3共同孵育15min,结果显示75n扩Inl bFGF对PKB活性的影响最显著,是对照组的近2倍。同时,以75n扩nil bFGF与CAOV3共同孵育不同时间,PKB活性在romin达到最高峰,为对照组的近13 .74倍。用P13K特异性抑制剂Wortmannin预处理细胞lh后,再施加bFGF处理,结果发现预处理组PKB的活性与未预处理组相比明显下降,具有显著性差异(P<0·05)。 2.bFGF对人卵巢癌细胞系CAOV3的细胞周期蛋白D表达水平的影响:以75n留血的bFGF与CAOv3共同孵育不同时间,cydinD表达水平在sh达到最高峰。用Wo咖annin预处理细胞lh后,再施加bFGF处理,Wo仆mannin预处理后在16h时间点cyc俪D表达水平与未预处理组相比下降39%,具有显著性差异(P<0.05)。结论 1.在人卵巢癌细胞系CAOV3,bFGF通过PI3称PKB信号转导途径增强PKB活性。特异性P13K抑制剂W ortmannin可以阻断这种作用。 2.bFGF对人卵巢癌细胞系CAOV3的周期蛋白D的表达的影响是通过P13份PKB信号转导途径来实现的。特异性PBK抑制剂W6咖in可以降低bFGF对cydinD的表达增强作用。