论文部分内容阅读
鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，传统的防制办法还存在许多问题。DNA疫苗是一种新的生物技术疫苗，具有可靠的安全性、高稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。TGF-β<,4>的功能包括损伤修复、促进细胞分化和生长，在鸡球虫保护性免疫中可以下调宿主的免疫和炎性反应，能刺激肠黏膜内皮在损伤后的修复。MZ5-7是E.tenella第二代裂殖子表面抗原基因，其重组蛋白对Eimeria tenella经口感染雏鸡能产生部分保护力。本研究将鸡TGF-β<,4>基因单独克隆入pVAX1.0或与MZ5-7基因融合克隆入pcDNA4.0b制备免疫调节型核酸疫苗，并用构建的核酸疫苗免疫动物，检测对Etenella攻虫的保护作用。
用RT-PCR方法，以初次感染E.teneila孢子化卵囊(约5.0×10<4>个／鸡)的鸡脾脏淋巴细胞(SP)总RNA为模板，成功扩增出预计大小的鸡TGF-β<,4>cDNA基因，并克隆入pMD18-T载体，测序结果显示其阅读框(ORF)为345bp，与GenBank上鸡TGF-β<,4>基因已知序列(M31160)BLAST的结果表明：核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7％和100％。将ChTGF-β<,4>基因克隆入pET-28a质粒，构建了pET28a-ChTGF-β<,4>原核表达载体， IPTG诱导后表达出的融合蛋白大小为17kD。
利用DNA重组技术，分别构建了DNA疫苗pcDNA4.0-MZ-TGF-β<,4>和pVAX1.0-TGF-β<,4>。酶切鉴定正确后，分别用重组质粒免疫14日龄鸡，1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织，用RT-PCR和Western-blotting检测保护性抗原的表达情况。结果表明该MZ5-7基因和TGF-β<,4>基因均能在注射部位肌肉里成功表达。
设立TGF-β<,4>重组蛋白、重组质粒pVAX1.0-TGF-β<,4>、pcDNA4.0-MZ-TGF-β<,4>三个免疫组进行免疫保护试验，经胸部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡，并设立感染非免疫和非感染非免疫对照及空质粒组。28日龄经口接种新鲜的E.tenella孢子化卵囊，一周后宰杀全部实验动物，进行盲肠病变计分、克粪便卵囊数、增重和综合抗球虫指数四个指标进行统计，检测其保护力的大小。结果表明，三个免疫组对感染球虫鸡的保护效果一般，但都可以显著减轻球虫感染后的盲肠病变，这可能与TGF-β<,4>的损伤修复功能有关，其中以pcDNA4.0-MZ-TGF-β<,4>重组质粒组保护效果略好，其相对增重率、克粪便卵囊数、盲肠病变计分和综合抗球虫指数分别是86.96％、0.18×10<6>、0.93和176.7，有可能作为候选的柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗。