【摘 要】
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在哺乳动物中,胆囊收缩素（CCK）被报道参与了生殖调控;然而其在鱼类生殖调控中的功能目前尚未见报道。本文通过生物信息学分析、在体和离体实验以及构建斑马鱼CCK基因敲除模型来探究其在鱼类生殖调控中的功能。主要研究结果如下:1.通过分子克隆和配体-受体选择性实验,明确斑马鱼CCK及其受体CCKR之间的配对关系;通过组织表达分析和免疫荧光定位探究CCK/CCKR在下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴中的分布。
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在哺乳动物中,胆囊收缩素（CCK）被报道参与了生殖调控;然而其在鱼类生殖调控中的功能目前尚未见报道。本文通过生物信息学分析、在体和离体实验以及构建斑马鱼CCK基因敲除模型来探究其在鱼类生殖调控中的功能。主要研究结果如下:1.通过分子克隆和配体-受体选择性实验,明确斑马鱼CCK及其受体CCKR之间的配对关系;通过组织表达分析和免疫荧光定位探究CCK/CCKR在下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴中的分布。本实验以斑马鱼为研究对象,首先通过分子克隆获得了斑马鱼两个CCKs亚型（CCK1＆CCK2）及其三个受体（CCKR1、CCKR2a和CCKR2b）的序列,序列分析发现CCK的成熟肽在哺乳动物和鱼类中非常保守,仅有一个氨基酸的差异。通过配体-受体选择性实验,我们发现斑马鱼CCK1和CCK2均能够激活其三个受体,不过CCK2对CCKR2b的激活力要显著高于CCK1。组织表达分析显示,CCKs及其受体CCKRs在脑、垂体和性腺中均有显著表达,这预示着CCK/CCKR可能通过HPG轴参与鱼类生殖调控。最后,利用免疫荧光定位,我们发现CCK在雌性和雄性斑马鱼性腺内均存在不同水平的表达,这预示CCK可能通过自分泌/旁分泌作用直接作用于鱼类性腺发挥功能。2.通过CRISPR/Cas9技术获得斑马鱼cck1-/-与cck2-/-模型,表型验证发现CCK缺失会导致其性腺发育不良。本实验使用CRISPR/Cas9技术将斑马鱼的cck1和cck2基因进行敲除。通过进一步的定向筛选与培育获得cck1-/-与cck2-/-斑马鱼。通过对敲除模型进行检测,我们发现cck1-/-与cck2-/-的性腺体指数小于野生型,其中cck2-/-的表征更为显著。在繁育突变型斑马鱼时我们发现,cck1-/-与cck2-/-相比野生型斑马鱼在繁育时的交配成功率、产卵量、受精率和出膜率均较低。组织学验证发现cck1-/-和cck2-/-的斑马鱼卵巢发育不良,精巢发育亦受到一定的影响。此外,相对于野生型斑马鱼,cck1-/-和cck2-/-垂体中lhβ和fshβ及性腺中cyp11a1a、cyp17a1a和cyp19a1a均显示出较低的m RNA水平。3.通过在体实验和性腺组织离体培养实验进一步验证CCK在斑马鱼生殖调控中的作用。对野生型斑马鱼腹腔注射CCK,定量PCR结果显示垂体中lhβ、fshβ和性腺中的cyp11a1a、cyp17a1a和cyp19a1a的m RNA的表达量均显著提高。此外,在离体条件下对斑马鱼性腺组织进行培养和CCK处理,定量结果显示相比于对照组,CCK处理组的cyp11a1a、cyp17a1a、cyp19a1a的m RNA水平有显著提升。这证明了CCK能直接作用于性腺,促进性腺内芳香化酶的分泌。
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