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一、前言自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell)是固有免疫系统的重要组分,其通过释放胞毒效应分子(穿孔素、颗粒酶等)而杀伤畸变的自身细胞及感染病原体的靶细胞。NK细胞无需致敏即能直接杀伤靶细胞,并可连续杀伤多个靶细胞。目前尚不清楚,NK细胞每次杀伤过程中所释放胞毒效应分子的量,及其连续杀伤过程中通过何种机制不断补充自身“弹药库”以维持“战斗力”。理论上,NK细胞可不断合成新的效应分子,但该过程涉及效应分子的糖基化修饰、剪切、构象改变,最后进入分泌性溶酶体,全程需数小时。因此,探讨NK细胞持续性杀伤过程中合成和储备胞毒效应分子的确切机制,有助于从新的角度阐明NK细胞杀伤功能的机制。免疫突触与神经突触有诸多相似之处。文献报道,神经突触胞吐后可发生有效的补偿性内吞,此对于维持突触功能具有重要意义。神经突触内分泌性囊泡与细胞膜融合后,包括膜蛋白的多种分子可迅速回收至神经细胞内,其生物学意义为：减少胞吐所致细胞膜表面积增大；回收的膜蛋白可参与形成新的分泌囊泡,从而有利于神经突触适应不断发放的神经冲动。除膜蛋白外,神经细胞还可回收可溶性神经递质。近年文献(包括本课题组前期研究)报道,免疫突触中存在双向运输的载体,也具有回收存储胞毒效应分子的分泌性溶酶体膜蛋白的能力。深入探讨胞毒效应分子的回收作用,有助于揭示细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和NK细胞持续性杀伤作用的机制。穿孔素是一类重要的胞毒效应分子,在NK细胞杀伤靶细胞过程中发挥重要作用,本文拟在课题组前期研究基础上,探讨NK细胞回收穿孔素的作用,并阐明其机制及生物学意义。早期内体是细胞回收细胞外物质的最初细胞器,早期内体体积增大提示外源性物质的进入。本实验用荧光标记的转铁蛋白作为示踪分子,观察其被NK92细胞内吞后的定位。转铁蛋白内吞后进入早期内体,导致后者体积显著增大,可作为细胞发生内吞的指标。此外,与早期内体共定位也表明内吞的分子已进入早期内体。通过观察NK92细胞早期内体,判断NK92细胞被靶细胞刺激后是否发生胞吞,结果发现：NK92细胞受靶细胞刺激15分钟后,其早期内体比对照组明显增大,提示NK92细胞发生内吞。乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, EGTA]可抑制NK92细胞胞吐,但并不影响NK92细胞与靶细胞间形成免疫突触。为探讨内吞发生的时相,我们在NK92细胞与靶细胞接触过程中加入EGTA,发现可显著抑制早期内体增大。提示NK细胞内吞继发性于胞吐之后。我们还发现,靶细胞刺激NK92细胞15分钟,穿孔素与早期内体出现明显共定位现象,而未受刺激的NK92细胞无此现象。另外,加入EGTA同样可抑制穿孔素与早期内体共定位。上述结果表明,NK92细胞杀伤靶细胞过程中出现穿孔素内吞,该效应继发于胞吐。首先应用放线菌酮抑制新蛋白质合成,以避免新生成的穿孔素干扰实验结果。继而应用针对不同胞吞途径的抑制剂,探讨NK92细胞内吞作用的机制。结果发现：应用针对clathrin途径的抑制剂后,受靶细胞刺激的NK92细胞内其穿孔素水平明显降低(与未用抑制剂的NK92细胞相比)；应用针对脂筏和胞饮途径的抑制剂并不影响胞内穿孔素水平。提示：穿孔素内吞效应为clathrin途径依赖性,脂筏和胞饮途径介导的内吞不参与穿孔素回收。借助共聚焦显微镜进一步证实穿孔素循clathrin内吞途径被回收,结果发现：在针对clathrin内吞途径的化学抑制剂作用下,NK92细胞受靶细胞刺激后,穿孔素和早期内体无共定位。另外,应用更具特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)证实穿孔素回收途径：用针对clathrin重链(clathrin heavy chain,CHC)的siRNA干扰NK92细胞clathrin表达,48小时后,靶细胞刺激并不导致穿孔素和早期内体共定位；而用针对无关序列的siRNA干扰NK92细胞48小时,受靶细胞刺激后,穿孔素和早期内体出现明显共定位。由此证实,穿孔素可以由clathrin内吞途径介导进入早期内体。用针对clathrin内吞途径的抑制剂阻断穿孔素回收,检测对NK92细胞杀伤靶细胞功能的影响：效应细胞与靶细胞比例为5：1和10：1,检测NK92细胞对原代猪内皮细胞(Primary porcine endothelial cells,PEC)和人红白血病细胞株(Humanerythroleukemia cell line,K562)的杀伤率；应用clathrin内吞途径抑制剂,NK92细胞对靶细胞杀伤率明显低于对照组；用针对CHC的siRNA干扰NK92细胞(48h),导致后者对靶细胞杀伤率明显降低(用针对无关序列的siRNA干扰作为对照)。为探讨clathrin途径依赖的胞吞在NK92细胞持续性杀伤靶细胞中的作用,将效应细胞与靶细胞比例设为1：2和1：5,检测不同时间点NK92细胞对靶细胞(PEC和K562)的杀伤率。与上述结果相印证,在效靶细胞比例倒置的情况下,NK92细胞对靶细胞的杀伤率随杀伤时间延长而逐步增高；抑制clathrin途径的内吞(化学抑制剂和siRNA)后,NK92细胞对靶细胞的杀伤率低于对照(未抑制clathrin途径)。为观察原代NK细胞是否也存在类似现象,用磁珠分离新鲜人外周血NK细胞(纯度>95%),用靶细胞刺激NK细胞15分钟,穿孔素与早期内体出现明显共定位现象,而静息状态下不发生此现象。同时,抑制clathrin介导的内吞途径,则NK细胞的杀伤功能降低。上述结果表明,clathrin途径介导的内吞在NK细胞杀伤功能中发挥重要作用,其机制可能与抑制穿孔素等效应分子回收相关。六、结论NK细胞受靶细胞刺激后,穿孔素循clathrin途径回收至早期内体中。此效应可被clathrin途径的化学抑制剂或特异性siRNA抑制,并导致NK细胞杀伤功能下降。提示：穿孔素回收对维持NK细胞杀伤功能具有重要意义。