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近年来,非酒精性脂肪肝病的患病率大幅提升,却鲜有文献报道其患病机制及相关信号通路。通常临床医生会建议患者通过调整自身生活习惯来延缓病程,缺乏特效药的支持。而我们在研究中发现,小鼠肝脏内有大量TRPML1蛋白表达,且非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏组织中TRPML1的表达水平相比于对照组明显上调,故猜测两者之间可能存在相关性。实验目的本论文拟探究TRPML1通道与非酒精性脂肪肝病之间的相关性及可能作用的信号通路。实验方法在非酒精性脂肪肝模型中探究TRPML1是否与其肝脏脂肪化程度相关。然后通过上调或敲低L02细胞及小鼠体内TRPML1基因,检测是否会对肝脏细胞脂肪化有影响。1.检测非酒精性脂肪肝模型小鼠体内TRPML1的表达对照饲料和高脂饲料分别喂养5只昆明小鼠,持续20周,进行非酒精性脂肪肝的造模,取小鼠肝脏进行H&E染色、测定其中的甘油三酯含量,检测非酒精脂肪肝病的造模效果。运用测序、免疫组织化学染色等实验方法确定TRPML1的表达位置与表达量。2.上调L02细胞中TRPML1通道对细胞脂质蓄积的影响ML-SA1是特异性TRPML通道激动剂,首先给与不同浓度ML-SA1刺激L02细胞确定给药最佳浓度,然后运用Western blot、GCaMP5转染成像等方法验证TRPML1通道是否能被ML-SA1特异性激活。体外实验中,我们用不同浓度血清与ML-SA1共同作用于L02细胞,通过油红O实验检测激活TRPML1对脂肪蓄积程度的影响。再用荧光脂质BODIPY与ML-SA1同时作用于细胞,运用流式细胞仪与荧光显微镜检测TRPML1通道激活对脂肪酸代谢过程的影响。NAFLD模型小鼠肝组织测序结果显示模型中cAMP通路及其下游基因ERK表达水平上调,我们用ELISA试剂盒检测L02细胞被不同浓度血清与ML-SA1处理后cAMP表达水平的变化。接着我们用内钙螯合剂处理L02细胞,检测无内钙条件下,给药ML-SA1后细胞内钙水平及蛋白ERK、磷酸化ERK表达水平的变化。再用cAMP抑制剂处理L02细胞,同样的方法检测抑制cAMP通路后ML-SA1对蛋白ERK与磷酸化ERK表达水平的影响。qPCR实验检测激活TRPML1对脂质代谢相关基因表达水平的影响。3.沉默L02细胞中TRPML1基因对脂质蓄积的影响设计shRNA慢病毒敲低TRPML1基因,油红O实验检测敲低TRPML1基因后ML-SA1还能否增加细胞内的脂质蓄积。Western blot检测shRNA敲低TRPML1的效率,以及敲低TRPML1后相关蛋白ERK、磷酸化ERK与SREBP1c的变化,qPCR实验检测敲低TRPML1对脂质代谢相关基因表达水平的影响。4.体内实验验证上调TRPML1表达对脂质蓄积的影响体内实验中,30只小鼠随机分为三组,分别隔天给与小鼠腹腔注射0、75、150μg/kg ML-SA1,上调小鼠体内TRPML1的表达,给药2次后,颈椎脱臼处死,检测其血液生化指标,染色检测肝脏组织解剖结构及TRPML1蛋白表达的变化。最后,用qPCR检测小鼠肝脏内脂质代谢相关基因表达的变化。实验结果1.NAFLD模型造模成功。测序结果显示,模型组TRPML1、cAMP通路关键分子PKA及ERK的表达水平相比于对照组显著上调,有统计学差异。免疫组织化学染色结果显示脂肪化较为严重区域TRPML1表达水平明显高于正常区域。2.TRPML1表达水平对ML-SA1呈剂量依赖性上调。L02细胞转染入GCaMP5质粒后,给与ML-SA1,细胞内钙浓度迅速上升。说明TRPML1可被ML-SA1特异性激活。L02细胞中脂质蓄积程度对血清以及ML-SA1浓度均呈剂量依赖性增长。此外,10μM ML-SA1能增加L02细胞摄入脂肪酸的速率。同时,摄入的脂肪酸红移速度明显降低,提示TRPML1通道激活后,脂肪酸处理速率减慢。而ML-SA1处理后细胞中脂质消耗速率基本无变化。表明TRPML1的激活通过增加脂肪酸的摄入和减慢脂肪酸参与脂质合成的速度而诱导肝细胞中的脂质积聚。cAMP及磷酸化ERK表达水平随ML-SA1剂量升高而上调,而ERK的总表达水平基本不变。同时,内钙螯合剂EGTA及BAPTA-AM处理过的L02细胞可抑制应用ML-SA1后ERK的磷酸化水平上调,提示ERK磷酸化水平升高是由TRPML1通道激活引起的。此外,cAMP信号转导抑制剂ESI-09和Rp-cAMP也可以抑制ML-SA1引起的磷酸化ERK表达水平上调,说明ERK位于cAMP通路的下游。所以,ERK的磷酸化与肝细胞脂质代谢密切相关。qPCR结果显示,ML-SA1的应用能够提高细胞内脂质调节与合成相关功能,而β-氧化相关因子保持不变。3.ShRNA慢病毒处理后,ML-SA1诱发的L02细胞脂质蓄积受到抑制。在GCaMP5转染成像实验中,敲低TRPML1后的L02细胞加入ML-SA1,内钙浓度变化基本消失,表明ML-SA1诱导的细胞内钙升高主要通过TRPML1通道介导。且shRNA-TRPML1处理可显著下调L02细胞中TRPML1、磷酸化ERK和SREBP-1c的蛋白表达水平。此外,qPCR结果显示敲低TRPML1可下调脂质代谢相关因子的表达水平,这表明TRPML1通道在肝脏脂质代谢起重要的调节作用。4.体内实验中,免疫组织化学染色结果显示TRPML1蛋白仍然在脂肪化区域高表达,且TRPML1的总体表达量和炎性浸润程度都随着ML-SA1剂量增加而升高。此外,肝组织甘油三酯含量测定结果显示,与control组相比,高剂量ML-SA1处理的小鼠肝脏甘油三酯含量较对照组增加了约2倍。血液生化指标显示血液中甘油三酯含量随着ML-SA1剂量的增加而升高,却无明显肝损。且肝脏中的脂质代谢相关基因表达水平也有明显的上调,表明激活TRPML1表达可促进肝脏的脂质积聚。结论TRPML1通道主要控制质膜上Ca2+的通透性,实验中发现TRPML1在NAFLD小鼠肝脏中大量表达,且其表达量与肝实质细胞脂肪化有强相关性。而且我们还发现TRPML1通道能影响Ca2+相关cAMP通路及其下游ERK磷酸化水平,导致脂质调控因子表达水平也发生了明显的变化。启发我们TRPML1可以通过Ca2+-cAMP-ERK信号影响肝脏脂质聚积,参与到NAFLD的发生发展中。