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中风、癫痫发作、慢性神经变性等中枢神经系统疾病靶分子途径较多,如递质紊乱、受体激活异常、细胞内钙超载及氧化应激等。新近研究发现,由于谷胱甘肽组成特性和结构柔韧性,使得其在中枢神经系统中除表现有抗氧化作用外,还具有神经递质与神经调质样作用,因此谷胱甘肽的这种多重作用能否为中枢神经系统疾病治疗带来帮助值得探讨。本实验通过观察古拉定——还原型谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸供体——N-乙酰半胱氨酸(NAC)对谷氨酸(Glu)诱导海马神经元死亡及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,探讨其作用机制,为上述药物应用于神经系统疾病治疗提供实验依据和指导。 实验选用新生Wistar大鼠原代培养海马神经元Glu细胞毒性损害模型,采用台盼蓝染色、DNA末端标记凋亡检测方法,分别评价GSH及NAC预处理与细胞毒暴露后快速给药两种不同给药方式对不同程度Glu诱导的海马神经元损伤的影响并相互比较;同时利用共聚焦显微镜(LSCM)测定细胞[Ca2+]i变化。结果如下: 1、海马神经元接种11~12天细胞胞体呈多形,折光性强,有明显立体感,核仁清晰可见,突起粗且多,末端多分枝,NSE免疫细胞化学染色,证实95%为神经元。 2、Glu对原代培养12天的海马神经元具有明显毒性作用,非竞争性N-甲基-D-门冬氨酸受体拮抗剂MK-801(10 μ M)可明显降低Glu诱导神经元死亡与凋亡。GSH及NAC预处理或细胞毒性暴露后快速给药对500 μ M Glu诱导的神经元死亡均没有明显保护作用,但1mM NAC可明显降低500 μ M Glu诱导的神经细胞凋亡。GSH及NAC对100 μ M Glu诱导的神经元死亡与凋亡均有保护作用,GSH细胞毒性暴露后快速给药优于同条件下预处理给药,而NAC则相反。1mM GSH细胞毒性暴露后快速给药及NAC预处理给药对loopMOhi诱导神经元死亡保护可达到甚至超过10 p M MK一801的保护效果。 3、经LSCM检测发现lmM GSH或NAC预处理三天能明显降低培养海马神经元基础C扩+水平,同时还能够抑制100pMGlu诱导的神经元细胞c扩+内流,以NAC为显著,甚至优于1 0 p M MK一801。虽然lmM GSH瞬时给药可诱导神经元细胞C扩+内流,但对神经元细胞存活率无影响,相同浓度 NAC则未发现有类似效应。 4、lmM、10mM GSH、NAC对神经元存活率无影响,100mM GSH可导致神经元细胞坏死、崩解,而经10OmM NAC作用的细胞虽然形态完整,但台盼蓝染色蓝染,原子力显微镜扫描见神经元细胞膜皱缩;予soop M Glu后神经元形态无改变,经Glu作用处于水肿状态下的神经元予loomMNAc后无崩解,培养基Caz+经Fluo一3(AM)标记后LSCM下无激发荧光。 结果提示: 一、无论预处理还是细胞毒性暴露后快速给药,古拉定及NAC对轻度Glu细胞毒性损伤均有保护作用。古拉定细胞毒性暴露后快速给药保护作用’优于预处理给药,NAC则相反,提示古拉定急救用药作用较为明显,NAC可能更适合于预防应用。.哪H及NAC抗轻度Glu细胞毒性损害除了通过增加细胞内GSH水平抗氧自由基外,还可抑制Glu诱导神经元细胞C扩+内流。 二、古拉定与NAC在明显高于体内药代动力学所能达到的浓度下才表现出毒性作用,提示临床应用安全。首次发现高浓度NAC具有固定作用:细胞形态完好,而膜完整性及通透性被破坏、失去对Glu细胞毒性反应、细胞内酶活性丧失。 三、GsH及NAc可影响神经元基础[C矛+1i,具体机制有待于进一步探讨。