戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)所致的一种经消化道传播的传染病,常因粪便污染水源而引起暴发流行。临床上主要表现为急性肝炎,在孕妇中病死率高达20%,慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝功能衰竭。此外,近年发现在器官移植和免疫缺陷患者中戊型肝炎可以慢性化并导致肝纤维化。戊型肝炎在发展中国家多见,但由于HEV的动物源性特点,近年在发达国家发病数也大幅增加,我国于2012年戊型肝炎发病人数已超过甲型肝炎发病人数,成为一个严重的公共卫生问题。因此,加强戊型肝炎疫苗的研发并及时推广应用对预防和控制戊型肝炎意义重大。HEV是一种RNA病毒,无包膜,基因组含有ORF1、ORF2和ORF3三个读码框架。其中ORF2编码的结构蛋白(pORF2)全长660个氨基酸(amino acid, aa),位于病毒表面,构成病毒的衣壳。我们的前期研究确定了HEV的中和抗原表位位于pORF2近羧基端的第452-617aa之间,并确定其是一种构象依赖性抗原表位。在此基础上我们利用大肠杆菌表达了含有HEV中和抗原表位的可溶性pORF2截短蛋白p179(aa439-617),发现p179能够有效诱导机体产生高滴度的HEV中和抗体,能够保护动物抵抗HEV的攻击,可以用于戊型肝炎重组疫苗的研发。目前该p179疫苗已完成临床Ⅰ期试验,Ⅱ期临床试验即将开始。pORF2有3个潜在的糖基化位点,分别为天冬酰胺(N) 137、N310和N562,在真核表达系统中表达时可能会在天冬酰胺残基上连接N-乙酰葡糖胺而被糖基化修饰。从pORF2晶体衍射结构可见,其P domain (aa456-606)以二聚体结构形成病毒衣壳表面的突起,与我们确定的HEV构象依赖性中和抗原表位的位置(aa452-617)吻合,而N562正好处于P domain突起顶部的中心位置,它是否真的能够糖基化?N562的糖基化及其突变对pORF2会产生什么样的生物学效应?对此研究甚少,已有的结果也不一致,甚至是相反的,而糖基化及其突变对p179二聚体形成、中和抗原表位以及疫苗效果的影响尚无任何报道。本研究用毕赤酵母真核表达系统替代原先的大肠杆菌原核表达系统,分泌性表达含N562糖基化位点的pORF2的p179疫苗片段,并同时表达针对N562糖基化位点的p179突变体,进而研究糖基化p179与点突变的p179在二聚体形成、抗原性、免疫原性以及诱导中和抗体产生等方面的异同,以深入了解HEV结构蛋白pORF2的生物学特征,寻求更为安全有效的戊型肝炎重组疫苗。本研究主要分为3个部分：一、HEV pORF2 N562潜在糖基化位点氨基酸基序的同源性分析为了解HEV结构蛋白pORF2 N562替在糖基化位点的保守性或变异程度,我们首先从GenBank下载了共210个HEV 1、2、3、4基因型及兔HEV、鼠HEV毒株的序列,利用生物信息学软件Lasergene 7.0对210个包含HEV结构蛋白pORF2 N562的氨基酸序列进行同源性比对,结果发现有6株毒株(GenBank accession numbers:AB189070, AB425831, AB593690, AB698071, AB740232和JQ026407)在N562位点糖基化基序由562NTT变成了562DTT,这6株毒株的共同之处是它们均为来源于日本的基因3型毒株。说明HEV结构蛋白pORF2 N562潜在糖基化位点基序N-X-T在具有高度保守性的同时尚具有一定的变异性。随着越来越多的新HEV毒株的出现,pORF2 N562潜在糖基化位点的氨基酸基序有可能发生其他更多的变异。二、p179及其N562突变体的毕赤酵母分泌性表达和特性分析为研究HEV结构蛋白pORF2 N562潜在糖基化位点是否真地发生糖基化修饰,糖基化修饰与否对p179疫苗带来什么影响,我们首先在生物信息学分析的基础上采用毕赤酵母真核表达系统分泌性表达野生型p179,同时通过重组PCR技术将N562进行4种定点突变,分别用酰胺类的谷氨酰胺(Q)、酸性氨基酸类的天冬氨酸(D)、亚氨基酸类的脯氨酸(P)和芳香族类的酪氨酸(Y)替代野生型的天冬酰胺(N),改变潜在糖基化位点的氨基酸保守性基序,并在毕赤酵母真核表达系统中进行分泌性表达。表达获得的p179蛋白分别命名为p179N562、p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y,通过SDS-PAGE结合衣霉素(tunicamycin)糖基化干预试验分析野生型p179N562和其突变体的糖基化修饰以及糖基化修饰对p179空间结构的影响。最后分别与抗-HEV特异性单克隆抗体及戊型肝炎恢复期病人血清(抗HEV IgG阳性)进行Western blot反应,评价糖基化和去糖基化对p179蛋白免疫反应性的影响。结果如下：A.利用重组PCR技术成功将HEV pORF2中的N562进行定点突变,突变为酰胺类的谷氨酰胺、酸性氨基酸类的天冬氨酸、亚氨基酸类的脯氨酸、芳香族类的酪氨酸,经测序验证。应用PSIPRED方法分析预测p179N562及p179N562Q、P179N562D、p179N562P、p179N562Y蛋白质二级结构,结果均以无规卷曲为主,其次为β折叠,最后为α螺旋。HEV p179N562和HEV ORF2p179N562Q、p179N562D、p179N562P二级结构一致,其中无规卷曲占61.45%、p折叠占35.20%、α螺旋占3.35%。p179N562Y与其他四种蛋白的二级结果略有差异,其中无规卷曲占60.34%、p折叠占36.31%、α螺旋占3.35%,第559与560位氨基酸由原来的无规卷曲变为p折叠。B.利用基因重组技术成功构建了分别含HEVp179野生型及其突变体的pPICZaA重组质粒,并在毕赤酵母菌株SMD1168中实现了分泌性表达。SDS-PAGE显示p179N562、p179N562Q和p179N562D呈二聚体,分子质量分别为48kDa、42kDa和42kDa,蛋白样品加热处理后均变为单体,分子质量分别为24kDa、21KDa和21KDa。无论是二聚体还是单体,野生型p179N562的分子质量均高于突变体,提示p179N562在酵母细胞真核表达时被糖基化修饰。另外2个突变体p1 79N562P和p179N562Y无论在天然状态下还是经加热处理后均呈单体形式,分子质量均为21kDa,不能形成二聚体。说明N562糖基化与否不是决定p179能否形成二聚体的决定因素,氨基酸本身的性质和结构决定了p179的二聚体形成。C.在衣霉素糖基化干预试验中,p179N562经衣霉素处理干预后分子质量由原来的48kDa降至42kDa,而p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y的衣霉素干预组与未干预组的分子质量保持一致,分别还是42kDa、42kDa、21kDa和21kDa,二聚体和单体的特征未发生改变。进一步证实p179N562在酵母细胞真核表达时被糖基化修饰,其分子质量的增加是N562发生糖基化的结果。D.在与HEV中和性单克隆抗体5G5进行Western blot反应时,p179N562、p179N562Q、 p179N562D以二聚体形式与5G5反应,经加热变为单体后不与5G5反应。p179N562和p179N562Q、p179N562D二聚体不与针对线性表位的单克隆抗体6F9反应,但加热变为单体后能与6F9反应。p179N562P、p179N562Y均以单体形式与5G5、6F9反应,但两者经加热后不与5G5反应,与6F9的反应不受影响。表明p179中和抗原表位的结构和功能与其是否形成二聚体无关,加热使二聚体解聚的同时破坏了中和性抗原表位。此外,在双抗体夹心法检测酵母培养上清中的p179抗原时,p179N562、p179N562Q、 P179N562D、p179N562P与p179N562Y具有良好的抗原性,但p179N562的检测效果差于突变体,并且这种差异有统计学意义(P<0.05),这可能与p179N562增加的糖链遮盖了部分抗原表位有关。三、p179及其N562突变体的免疫原性和免疫血清的HEV中和作用为进一步比较糖基化p179N562与非糖基化的p179突变体的免疫原性,尤其是它们所诱导的免疫血清对HEV中和作用的差异,我们将等量的p179N562、p179N562Q、 p179N562D、p179N562P、p179N562Y分别免疫小鼠,定期采集小鼠血清,用ELISA检测抗-HEV IgG抗体,观察抗体的变化直至免疫后40周。此外,我们采用基于PCR的HEV体外中和试验,来评价p179N562、p179N562Q、p179N562D、p179N562P、p179N562Y免疫小鼠血清的中和活性。结果如下：A. p179N562、p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y免疫小鼠后,免疫血清在第3周可以检测出抗-HEV IgG抗体,大多在免疫后的第8周抗体滴度达到高峰,此后逐渐下降,但直至免疫后40周各组免疫血清中抗-HEV IgG抗体仍持续阳性,说明p179N562、p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y具有良好的免疫原性。B.HEV的细胞培养十分困难,尚无常规的体外中和试验,也无敏感小动物模型。我们采用基于一步法RT-PCR的体外中和试验检测P179N562、P179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y小鼠免疫血清的中和作用,其中和效价分别为1：20、1：80、1：20、1：640和1：160,以p179N562P免疫血清的中和作用最强,糖基化的p179N562诱导的中和抗体效价低。综上所述,我们的研究结果表明：1.HEV结构蛋白pORF2 N562潜在糖基化位点的氨基酸基序N-X-T具有高度的保守性,但也具有一定的变异性,部分3型毒株由562NTT突变成562DTT,糖基化基序丢失。2.HEV结构蛋白pORF2羧基端片段p179野生型p179N562及其4种N562定点突变体p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y均能在毕赤酵母真核表达系统中分泌性表达,p179N562被糖基化修饰,而突变体不能被糖基化修饰。3.分泌性表达的野生型p179N562及N562突变成谷氨酰胺的p179N562Q或天冬氨酸的p179N562D均天然形成二聚体,加热变性则二聚体变成单体,但突变成脯氨酸的p179N562P或酪氨酸的p179N562Y只以单体形式存在。4.所有二聚体p179和天然单体p179均能与中和性单克隆抗体5G5反应,但加热变性后形成的所有单体p179基本不再与5G5反应,说明p179中和抗原表位的结构和功能与其是否形成二聚体无关,加热处理能够同时破坏p179的二聚体结构和中和抗原表位。5.野生型糖基化的p 179N562以及N562突变体非糖基化的p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y均具有良好的免疫原性和抗原性,均能诱导HEV中和抗体的产生,说明N562不参与p179中和抗原表位的形成,但N562糖基化的糖链有可能对中和抗原表位有部分遮盖作用,它诱导的中和抗体效价低；非糖基化的N562突变体p179N562P的天然单体诱导中和抗体的效价最高,有可能成为戊型肝炎重组疫苗的候选品,值得深入研究。