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背景 大肠癌是严重威胁人类的主要肿瘤之一。目前的治疗手段主要以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗和放疗。但术后肿瘤易复发，尤其是肝脏转移极易发生。据报道，大肠癌肝转移病人经手术治疗后5年生存率不到30％。随着分子生物学及基因工程的迅速发展，基因治疗已成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法引起了许多学者的兴趣，成为近年基因治疗的研究热点。但传统的载体如逆转录病毒和脂质体等的转染效率和表达效率不高，再加上单一的自杀基因疗法易产生耐药性等原因，因而自杀基因疗法的效果欠佳。腺病毒作为新兴的载体因其转染效率和表达效率高而日益受到重视，成为肿瘤基因治疗的主要载体之一。 目的 传统的细胞内同源重组腺病毒载体制备方法步骤繁多、工作量大，而且成功率较低。He等采用细菌内同源重组法制备重组腺病毒，使制备过程大为简化，但对实验室的要求高，成功率仍不高(20％)。本研究的目的是构建CMV启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒，应用于大肠癌的治疗。 方法 本研究在细菌内同源重组法基础上设计了两步氯化钙转化法以提高成功率。利用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrackCMV中构建成转移质粒pAdtrackCMV-CDTK，经酶切线性化后，转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，并用PCR鉴定所得病毒。滴度测定后，体外感染Lov。大肠癌细胞，进行杀伤实验。结果 结果显示，以JM 1 09细菌为模板，PCR扩增出的E. eoli CD基因和以pREps一TK中的TK基因模板，PCR扩增出的HSV- 1 TK基因经序列测定均与报道一致。应用氯化钙法由pAdtrackCMv- cDTK转化AdEasier一1细菌，可获得极高比例的(20/20)阳性重组腺病毒克隆。PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒。CD、TK融合基因全长2439bP，编码813个氨基酸。重组腺病毒感染Lovo细胞24h后，50%Lovo细胞可出现绿荧光表达。加入5一FC和GCV的一组，4d后可见绿荧光表达的Lov。细胞被杀死，而无绿色荧光表达的Lov。细胞也有部分被杀死，即旁观者效应。而不加前药的对照细胞，观察到绿荧光表达，但未见细胞杀伤。 结论 实验表明，应用两步法成功构建了CMV启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。