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为了研究灵芝肽(GLP)在体外对人肝癌HepG2细胞生长抑制及诱导凋亡的作用,探讨其诱导细胞凋亡的机制,初步揭示GLP的构效关系,本文采用体外细胞培养技术,HepG2细胞经GLP处理后,光镜、荧光显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化;用四氮甲唑蓝(MTT)法检测GLP对细胞生长抑制作用;借助于激光共聚焦显微镜观察细胞钙离子浓度变化;流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡率;westernbloting法检测凋亡相关基因的表达以及分光光度法检测细胞Caspase-3酶活性,研究GLP处理肝癌HepG2细胞后,细胞凋亡的情况。并用HPLC-MS/MS研究了GLP的一级结构。结果如下:1、人肝癌HepG2细胞凋亡形态学研究镜下可见细胞出现典型凋亡细胞形态学改变:细胞染色质浓缩,聚集于核边缘形成块状;细胞膜出泡、细胞体积缩小,核固缩深染,凋亡小体形成。2、灵芝肽对人肝癌HepG2细胞生长抑制、周期和凋亡率研究MTT法显示灵芝肽对人肝癌HepG2细胞抑制作用较强,且存在有明显的量效关系和时效关系。HepG2细胞经GLP处理48h后,使HepG2细胞阻滞于G0/G1期,随着GLP浓度升高,其G0/G1期的细胞比例随之增加;同时细胞的早期、晚期和总的凋亡率亦均随之增加,存在剂量-效应关系。3、灵芝肽致人肝癌HepG2细胞凋亡机理研究激光共聚焦(LSCM)检测表明,HepG2细胞经GLP诱导48h后,胞内钙离子浓度明显增加;western bloting检验结果显示,抑制凋亡基因bcl-2和Survivin表达下调,而促凋亡基因p53表达上调,并且都存在剂量依赖性;比色法结果表明,Caspase-3被激活,并且Caspase-3酶活性与GLP浓度有剂量依赖性。4、灵芝肽一级结构研究鉴定出了一个5肽和一个7肽,m/z=566.8的准分子离子其可能的一级结构是:His-Ala-Leu(Ile)-Leu(Ile)-Leu(Ile)或Ala-His-Leu(Ile)-Leu(Ile)-Leu(Ile)m/z=814.5的准分子离子的一级结构是:Leu(Ile)-Leu(Ile)-Leu(Ile)-Thr-Phe-His-Ala