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构建反义Survivin真核表达载体(anti-pcDNA3.1-svv),转染胃癌细胞,检测Survivin基因对细胞增殖和诱导凋亡的作用及对多西他赛的化疗增敏作用。并进一步探讨Survivin对化疗增敏和逆转耐药的机理。
方法:1、采用RT-PCR的方法从SGC7901细胞中提取Survivin基因,以T-A策略与载体pcDNA3.1相连,通过测序检测载体构建是否成功。2、反义Survivin核酸转染SGC7901。通过RT-PCR及Westernblot检测SurvivinmRNA及蛋白表达。以细胞增殖曲线、流式细胞技术和电镜观察方法检测降低Survivin表达后对细胞增殖和凋亡的影响。3、以RT-PCR及细胞免疫组化的方法检测转染前后Survivin及MDR-1的表达。4、诱导SGC7901耐药,转染反义Survivin核酸,检测转染前后耐药细胞Survivin及MDR-1的表达,对多西他赛敏感性。5、SGC7901-SVVanti细胞接种裸鼠,观察成瘤性及裸鼠组织Survivin蛋白的表达。
结果:1、核酸序列分析证明载体构建成功。2、SGC7901-SVVanti细胞SurvivinmRNA及蛋白是未转染组的23.7%和27.1%,差异显著。SGC7901-SVVanti组细胞凋亡率(19±1.23)%,与转染空质粒组(2±0.79)%及未转染组(2±0.65)%相比,差异显著。SGC7901-SVVanti细胞电镜下呈凋亡晚期改变。SGC7901-SVVanti细胞生存抑制率达到71.2%,与转染空质粒组(1.6%)比较,差异显著3、SGC7901转染后MDR-1及Survivin表达下降,对多西他赛敏感性增加。4、耐药细胞转染后MDR-1及Survivin表达较前下降,对多西他赛较前敏感。5、转染后胃癌细胞种植裸鼠,肿瘤生长慢,肿瘤组织Survivin蛋白表达下降。
结论:1、反义Survivin核酸能有效降低胃癌细胞Survivin表达。2、反义Survivin核酸能够抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡。3、反义Survivin核酸能够通过降低MDR-1的表达增加胃癌对多西他赛的敏感性,Survivin表达与MDR-1具有相关性。5、反义Survivin核酸可以抑制裸鼠肿瘤生长。