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问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(简称钩体)感染引起的钩端螺旋体病(Leptospirosis)是全世界范围内广泛流行的自然疫源性人兽共患病，尤其多见于水稻种植地区，因而我国是钩体病的主要疫区之一。问号钩体自然宿主众多，并可在宿主肾脏长期生存、繁殖并随尿液排出，污染土壤和水源，人类通过接触疫土和疫水而感染，故钩体病是各国洪涝灾害时重点防疫和监控的传染病之一。
接种疫苗是预防和控制钩体病流行最有效的措施。但钩体血清群众多，各群间交叉保护作用较弱或无，不同地区优势钩体血清群、型可有明显差异，故目前国内外均采用当地流行的主要钩体血清群、型来制备多价全菌死疫苗。多价钩体全菌死疫苗副作用较大，且对其未包含的其它钩体血清群感染保护作用极其有限。由我国学者研制的国际上首个钩体组分疫苗——多价外膜疫苗，虽有免疫效果好、副作用小等优点，但仍无对不同钩体血清群的交叉免疫保护力。因此，寻找钩体属特异性保护抗原，进而研制出对不同血清群有广泛免疫交叉保护作用的通用型钩体基因工程疫苗，对预防和控制钩体病具有重要意义。
Shang、Haake和Cullen等先后分别从问号钩体基因组DNA中克隆了全长819 bp、编码272个氨基酸的lipL32基因、全长1068 bp、编码355个氨基酸脂蛋白的lipL41基因，全长1014bp、编码337个氨基酸的ompl1基因和全长561bp、编码186个氨基酸的lipL21基因并认为上述基因存在于所有问号钩体菌株中。我们以往的研究结果证实，我国15群15型致病性问号钩体参考标准株基因组DNA中均可扩增出上述全长基因片段，但分别存在lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2、ompl1/1、ompl1/2和ompl1/3基因型。其中lipL32/1和lipL41/1基因型包含了我国所有主要流行的钩端螺旋体血清群，如黄疸出血群、流感伤寒群、赛罗群、波摩那群、七日热群、秋季群和犬群等，而含有ompL1/3基因型的钩体血清群引起人类钩体病极为罕见，因此不作为此次研究的对象。
由于保存不当，lipL41/2原核表达系统丢失，为了确保实验的完整性，本研究重新构建了lipL41/2原核表达系统，其它原核表达系统由浙江大学病原生物教研室提供。IPTG诱导rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLip41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达，采用Ni-NTA亲和层析法，提取了四种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物。SDS-PAGE检测重组蛋白的表达和纯化结果。采用盐变法提取了我国15群15型问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白。以相应兔抗血清为一抗，采用Western Blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性。建立了基于rLipL21、rLipL32s、rLipL41s、rOmpL1s的ELJSAs，检测钩体病人血清中相应特异性抗体水平及其类型。采用胶体金免疫电镜技术，对上述蛋白进行膜定位。研究发现rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％，各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带。重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性。各血清群钩体外膜中均可检出上述四种外膜蛋白，但LipL21仅存在于问号钩体中。LipL21、LdpL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原，可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中，rLApL21特异性IgM阳性率分别为69.9％(109/156，血清标本1：50稀释)和63.5％(99/156，血清标本1：100稀释)，特异性IgG阳性率为均为99.4％(155/156)。rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为91.3％～92.9％、90.4％～92.2％、84.6％～87.8％、78.2％～83.3％、67.9％～79.5％和75.0％～75.6％；特异性IgG阳性率分别为99.4％～99.4％、97.4％～98.1％、69.2％～81.4、75.0％～80.1％、71.8％～79.5、75.0％～76.9％。上述实验结果提示，LipL21、LipL32s、LipL41s、OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时，上述蛋白均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体，且每种基因的不同基因型之间有广泛的抗原交叉反应。
我们的Western Blot结果显示，所有目的重组蛋白兔抗血清均能与16株钩体外膜蛋白(OEP)制品中某一蛋白条带发生较强的免疫反应，其位置与lipL32/1、lipL32/2、lipL41/1、lipL41/2、ompL1/1和ompL1/2基因表达产物分子量相符。与MAT结果相似，即上述基因表达产物是存在于钩体表面、具有良好免疫反应性的属特异性蛋白抗原。其中IJpL21条带着色最弱，提示其表达量可能较其它蛋白为低。LipL32/1条带略浓于LipL32/2、LipL41/1、LipL41/2、OmpL1/1、OmpL1/2，且该基因型几乎包括了我国流行最广的钩体血清群如黄疸出血群、犬群、致热群、秋季群、澳州群、波摩那群、流感伤寒群和七日热群，以及巴达维亚群、赛罗群、明尼群，且实验结果也证实rLipL32/1表达产量最高，提示rLipL32/1应是研制钩体通用性疫苗及检测试剂盒的首选抗原。LipL41/1、LipL41/2、OmpL1/1和OmpL1/2条带无明显差异，但lipL41/1基因型所包含的钩体血清群与lipL32/1基因型几乎完全相同；但rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量高于rLipL41/1和rLipL41/2。因此，rLipL41/1、rLipLA1/2、rOmpL1/1、rOmpL1/2作为疫苗及检测试剂盒候选抗原各有优劣，故若研制多价抗原基因工程疫苗或检测试剂盒时，应综合考虑进行选择。