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研究背景：
转化生长因子Beta(TGF-β)是公认的促肾间质纤维化的关键因子,由于TGF-β是一把双刃剑,具有促纤维化和抗炎的作用,这是以抑制TGF-β抗纤维化的治疗陷入困境。最近Smad3基因敲除小鼠提示:Smad3通路在间质纤维化形成中处于中心地位,这提示局部抑制该通路可用于临床治疗梗阻性肾病。RNAi沉默目的基因的特点能够用来治疗肾脏疾病,但用传统的病毒载体和非病毒转染方法把siRNA和shRNA导入肾脏,缺乏安全性和有效性,其临床应用会受限。
第一部分超声微泡系统介导基因转染大鼠肾脏的实验研究
研究背景:安全性是人类临床基因治疗中最重要的主题,从这个观点出发,最好的是发展一种显著的非病毒基因转染方法,最近研究表明:超声能引起细胞膜通透性并增加基因的转染。目的:研究optison介导的靶向肾脏传输的效率和相关条件.
方法:健康雄性Wistar大鼠(由军科院实验动物中心提供),150 g左右,分为以下几组:
1不同浓度optison微泡对转染效率的影响:健康雄性Wistar大鼠54只(由军科院实验动物中心提供),150 g左右,分为对照组(C组,n=6)、超声+CY5-ODN+0％optison组(0％组,n=6)、超声+CY5-ODN+5％optiso组(5％组,n=6)、超声+CY5-ODN+10％optison组(10％组,n=6)、超声+CY5-ODN+25％optison组(25％组,n=6)超声+CY5-ODN+50％optison组(50％N,n=6)
2不同时间对转染效率的影响:Wistar大鼠30只以25％和50％的optison浓度照射1和2分钟,对照组(C组,n=6)超声+CY5-ODN+25％optison组(25％1分钟组,n=6)超声+CY5-ODN+25％optison组(25％2分钟组,n=6)超声+CY5-ODN+50％optison组(50％1分钟组,n=6)超声+CY5-ODN+50％optison组(50％2分钟组,n=6)350％微泡1分钟对转染RFP-N1的影响:健康雄性Wistar大鼠36只(由军科院实验动物中心提供),150 g左右,分为对照组(C组,n=6)、超声+RFP-N1+optison组(U+RFP-N1+微泡组,n=6)、超声+RFP-N1+optison组(1天组,n=6)、超声+RFP—N1+optison组(3天组,n=6)、超声+RFP—N1+optison组(7天组,n=6)450％微泡1分钟对转染ODN的抑制效果健康雄性Wistar大鼠36只(由军科院实验动物中心提供),150 g左右,分为对照组(C组,n=6)、超声+CY5-ODN+optison组(U+ODN+微泡组,n=6)、超声+CY5-ODN+optison组(1天组,n=6)、超声+CY5-ODN+optison组(3天组,n=6)超声+CY5-ODN+optison组(7天组,n=6)。并检测血清中AST ALT尿素氮肌苷,LDH以评价基因转染的生物学影响。并用RT-PCR、Western blotting检测了CY5-ODN抑制CTGF的效果。
结果:cy50DN或RFP—N1基因转染率在肾小球细胞是95％,血管和血管周围细胞90％,髓质小管和间质细胞为70-80％。基因转染肾脏后血清学检查肝肾功能没有改变,尽管LDH有所升高,但在7天时已经显著下调(P<0.05)。转染CY5-ODN能有效抑制CTGF的表达。
结论:超声联合optison能够显著增强肾脏基因转染的效率,这种非病毒转染方法治疗用来治疗肾脏疾病.
目的:构建抑制Smad3的shRYA表达载体。
方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经Bgl11、Hind111双酶切同时CIP处理后的pSUPER载体的poly111 H1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立非特异对照。
结果:重组构建的pSUPERSmad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。
结论:载体的成功构建,为进一步研究其抑制Smad3的打下基础。
目的:该研究采用一种新近发展的显著、高效和安全的非病毒转染方法——超声微泡转导系统,把编码shRNA Smad3的pSUPER质粒局部转染单侧输尿管梗阻大鼠肾脏,研究对肾间质纤维化的治疗作用及机制.
方法:将雄性Wistar大鼠随机分成四组(n=6),①假手术对照组(Sham)；②UUO不用药组(UUO)；③UUO+超声+optison+pSUPERshNC(control)(④UUO+超声+optison+pSUPERshSmad3(shSmad3)；7天后处死大鼠观察以下指标(1)PAS染色观察病理改变,Masson’s染色观察肾间质纤维化的面积；(2)用RT-PCR检测Smad2、Smad3mRNA的表达,Northern blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA的表达:用Western Blot检测Smad2/3、Smad3、P-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的蛋白表达；(3)免疫荧光检测Smad2、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的表达。
结果:(1)PAS结果表明UUO或Control组出现严重的小管萎缩,小管间质单核细胞浸染及纤维化,shRNA smad3明显减轻。(2)与Sham比较,UUO或Control组Smad2/smad3mRNA蛋白表达没有显著差别(p>0.05)而P—Smad3水平显著增加(p<0.05),shRNA smad3能显著减轻下调Smad3mRNA、蛋白表达水平及p—Smad3水平(p(0.05)而对Smad2mRNA、蛋白表达没有显著差别(p>0.05),进一步被免疫荧光证实。(3)与Sham比较,UUO或Control组CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMAmRNA蛋白表达水平显著增加(p<0.05),shRNAsmad3能显著减轻下调CollagenⅡ、CollagenⅢ、α—SMAmRNA蛋白表达水平(p<0.05)进一步被免疫荧光及Massons染色证实。结论:(1)超声微泡介导shRNA smad3转染能显著抑制Smad3的表达及活化,并显著减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化；(2)TGF-β/Smad3信号通路在肾间质纤维化中具有重要作用；(3)超声微泡介导shRNA smad3为进一步临床防止纤维化疾病提供了新的安全高效无创的基因治疗手段.