【摘 要】
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目的:有研究报道lncRNANORAD可影响细胞倍性,而血小板的生成与巨核细胞的多倍性息息相关,因而猜测其可能对巨核细胞分化过程产生影响。本研究旨在探究lncRNANORAD在巨核细胞分化及血小板生成过程中具有怎样的影响及其可能的分子机制。方法:（1）体外实验中利用CD34+造血干细胞和K562细胞建立巨核谱系分化模型,利用慢病毒或腺病毒载体干扰lncRNANORAD的表达,然后在巨核谱系分化的1
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目的:有研究报道lncRNANORAD可影响细胞倍性,而血小板的生成与巨核细胞的多倍性息息相关,因而猜测其可能对巨核细胞分化过程产生影响。本研究旨在探究lncRNANORAD在巨核细胞分化及血小板生成过程中具有怎样的影响及其可能的分子机制。方法:（1）体外实验中利用CD34+造血干细胞和K562细胞建立巨核谱系分化模型,利用慢病毒或腺病毒载体干扰lncRNANORAD的表达,然后在巨核谱系分化的10～13天收集细胞,并且用荧光标记的CD41和CD42b的抗体对巨核细胞及血小板表面标志物进行染色,流式检测其分化比例;PI染色检测细胞的倍性;β1-tubulin免疫荧光染色检测微管蛋白聚集延伸情况。（2）体内实验利用CRISPR-Cas9技术获得的NORAD基因全身敲除小鼠进行X射线辐照,并于辐照前及辐照后的0～30天内定期检测小鼠外周血循环血小板数。（3）利用荧光原位杂交技术（FISH）确定lncRNANORAD在造血干细胞分化过程中在细胞核和细胞质的定位;利用RNA免疫共沉淀技术（RIP）证明在造血干细胞中lncRNANORAD与PUMILIO蛋白的相互结合;通过蛋白免疫印迹技术（WB）检测影响巨核细胞分化的蛋白ERK1/2的活化水平以及其磷酸化调节蛋白DUSP6的表达情况。结果:（1）LncRNA NORAD敲低抑制早期巨核细胞的增殖,促使其成熟,并促进了巨核细胞整体倍性的增加,而且微管蛋白的聚集增多,从而使血小板产生增多;LncRNANORAD过表达使巨核细胞倍性降低,抑制了巨核细胞的分化,使血小板产生减少;而过表达PUMILIO同lncRNA NORAD敲低一样对巨核谱系分化具有促进作用。（2）辐照之前NORAD敲除小鼠外周血血小板计数要明显多于野生型小鼠,辐照后8～10天血小板数目降至最低并开始恢复,在血小板恢复的第12天和第20天时NORAD敲除小鼠外周血血小板计数要高于野生型小鼠。（3）LncRNA NORAD敲低之后DUSP6表达降低,P-ERK1/2表达升高;单独过表达PUMILIO亦使得DUSP6表达降低,P-ERK1/2表达升高;而在敲低lncRNA NORAD的基础上再下调PUMILIO会使降低的DUSP6的表达量回升,并且使升高的P-ERK1/2的表达量回落。结论:（1）LncRNA NORAD通过影响早期巨核细胞的增殖、巨核细胞的倍性及巨核谱系分化过程从而最终影响血小板的产生。（2）NORAD敲除小鼠经X射线辐照后血小板恢复速度快于野生型小鼠。（3）LncRNA NORAD通过结合PUMILIO干扰DUSP6蛋白的表达,进而影响ERK1/2的磷酸化水平,从而影响巨核细胞谱系的分化。
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