论文部分内容阅读
目的结节乳头体核(TMN)和下丘脑腹外侧视前区(VLPO)分别是重要的促觉醒与促睡眠中枢,二者的时相切换,实现了睡眠-觉醒的调节和控制。随着研究的深入,小胶质细胞作为中枢神经系统中重要的免疫功能细胞,其在中枢神经系统新的功能作用不断地被发现。小胶质细胞是否也在睡眠-觉醒调控中起作用却很少报道。睡眠剥夺常被作为研究睡眠觉醒机制的一种重要研究方法。我们采用睡眠剥夺方式,使用已被证明的可以抑制小胶质细胞活化的四环素类抗生素药物,米诺环素,探讨小胶质细胞在睡眠-觉醒稳态调节中的作用。方法1.实验动物分组:根据实验设计,C57BL/6小鼠用于二个部分。1.1多导睡眠描记:为了观察米诺环素对正常睡眠小鼠是否有影响,将小鼠分为生理盐水自然睡眠组(NS-TODS组)和米诺环素自然睡眠组(mino-TODS组)。为了观察米诺环素对睡眠剥夺小鼠是否有影响,将小鼠分为NS-TODS组,睡眠剥夺生理盐水组(NS-SD组)和睡眠剥夺米诺环素组(mino-SD组)。1.2检测小鼠在睡眠-觉醒脑区小胶质细胞荧光表达:检测iba-1在VLPO、TMN以及视交叉上核(SCN)小胶质细胞内表达,对实验小鼠连续腹腔注射生理盐水和米诺环素七天以后,NS-SD组和mino-SD组行睡眠剥夺,NS-TODS组仅注射生理盐水自然睡眠五小时,之后麻醉灌流取脑组织。2.动物手术小鼠经戊巴比妥行腹腔麻醉后固定于小鼠脑立体定位适配器上,将小鼠头顶毛剪去,酒精消毒皮肤并剪开,分离皮下组织,用生理盐水洗净后使颅骨完全暴露,以前囟为参照点,分别位于前囟前1.0 mm、旁开1.5 mm和后囟前1.0mm、旁开1.5 mm处用颅骨钻钻通颅骨,但不弄破硬脑膜,将脑电电极埋入,两根肌电电极分别插入两侧的颈部肌肉内。用牙科水泥将电极固定于颅骨上,之后腹腔注射青霉素,缝合伤口,将小鼠侧卧位放入屏蔽箱恢复笼内,保证饮食和水的充足,并每日观察小鼠恢复情况3.多导睡眠描记方法在小鼠实施手术后的,侧卧保温毯中,待苏醒后放入屏蔽箱中,进行为期一周的恢复。第八天,小鼠头部电极记录排线和多通道万向轮进行结合,度过适应期3天后,开始正式进行记录。屏蔽箱内光照8:00-20:00,记录从早8:00(记为ZT0)开始,用Acqknowlege4.2软件记录小鼠的脑电肌电活动,记录过程中小鼠能够自由饮食和摄水,活动不受限制。每次描记均从8:00开始,连续记录24小时。4.睡眠状态数据统计标准脑电数据以4 s为时间段分析,把睡眠-觉醒周期划分成觉醒(W),为显著的肌电活动以及低幅快波脑电;非快动眼睡眠(NREM),肌电活动显著降低以及高幅慢波脑电;快动眼睡眠(REM),以肌电安静及低幅慢波脑电为特征。5.睡眠剥夺方法睡眠剥夺时将小鼠置于有机玻璃圆桶(直径22 cm,高38 cm),从8:00～13:00对小鼠每隔15 s用毛刷触碰小鼠臀部,小鼠被强迫保持清醒状态,以此达到睡眠剥夺的目。6.冰冻脑组织制备小鼠麻醉后,经左心室插管行心内灌注固定。在胸骨剑突部位定位,手术剪剪开,使心脏包膜暴露,用眼科剪刀将心包膜打开,使整个心脏暴露出来,止血钳夹闭下腔静脉,然后左心室插入输液器针头,迅速剪开右心耳。灌注分为2个部分:先快速灌注4℃生理盐水,至流出液体变清;随即灌注固定液4%的多聚甲醛(用PBS缓冲液配制)。灌注速度先快后慢,约20-30分钟灌完。待僵硬后取出组织(较为完整的小鼠脑),灌流完成。将取出的脑组织置于4%多聚甲醛(PBS缓冲液配制)中固定24小时,然后分别置于含10%,20%和30%蔗糖的PBS中脱水,待组织沉底后方可进行冰冻切片。7.冰冻切片将用包埋剂包埋的脑组织迅速冰冻后进行脑切片。切片的厚度为30 μm,对照小鼠脑图谱,将含有VLPO,TMN和SCN脑区的脑片放置于4℃冰箱保存。.8.检测VLPO,TMN和SCN中小胶质细胞免疫荧光检测将含有VLPO,TMN和SCN脑切分别用0.01 mol/L PBS清洗和0.3%TritonX-100通透处理后,再分别用一抗和二抗孵育。一抗为iba-1,小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体;二抗为Alexa fluor488,绿色荧光标记物。9.定量分析小胶质细胞直径,光密度在高倍镜视野获取VLPO、TMN以及SCN脑区图像,用ImageJ-win32/fiji软件,对荧光图像进行分析,用平均荧光密度值AOI(area of interest),细胞平均直径,细胞数量反应蛋白表达情况。10.统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据的统计分析,计量资料用均数土标准误(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析和t检验。检验水准P<0.05视为差异有统计学意义。结果(1)NS-TODS组和mino-TODS组小鼠,觉醒(W)、快速眼动(REM)睡眠以及非快速眼动(NREM)睡眠时间呈昼夜节律变化,两者之间差异无统计学意义。(2)与NS-TODS相比,NS-SD组可见明显的睡眠增加,主要表现在NREM+REM睡眠总量增加(P<0.05)。(3)与NS-SD组相比,mino-SD组在ZT5-6时间段内,其觉醒总量增多(P<0.05);但在ZT6-11时段内,无显著性变化。(4)小胶质细胞在VLPO,SCN,TMN脑区的表达与用PBS代替一抗的空白对照相比,iba-1在VLPO,SCN,TMN脑区阳性表达明显,呈现绿色染色,细胞容易辨认,结构清晰,突起分明。(5)小胶质细胞在VLPO区域的表达情况统计表明与NS-TODS组相比,NS-SD组VLPO区的小胶质细胞较小,差异无统计学意义,与min-SD组小胶质细胞相比细胞直径大,细胞个数多(P<0.01)。(6)小胶质细胞在TMN区域的表达情况与NS-TODS相比,NS-SD组睡眠剥夺五小时后,TMN区的小胶质细胞直径明显增大(P<0.01),其荧光强度增强(P<0.05);而mino-SD组睡眠剥夺五小时后,小胶质细胞体积有变小的趋势,但差异无统计学意义。(7)小胶质细胞在SCN区域的表达情况统计表明在NS-TODS组,NS-SD组min-SD组这三组小鼠SCN区域的小胶质细胞荧光表达未见明显差异,sholl分析差异无统计学意义。结论:VLPO,TMN脑区内的小胶质细胞可能参与睡眠—觉醒稳态的调节。