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木聚糖酶是一种重要的工业用酶，并被广泛的应用于饲料工业、纸浆工业以及生物质能等领域。研究表明，在饲料中添加一定剂量的木聚糖酶，能有效提高动物对饲料消化利用率，改善动物消化道健康，增强动物免疫能力。然而大部分天然木聚糖酶不能耐受饲料在制粒过程中的高热环境以及动物消化道内的复杂理化环境。因此，开发具有优良的耐热、耐酸碱能力的木聚糖酶已然成为当前木聚糖酶研究的热点问题。本研究以里氏木霉的主要木聚糖酶基因(Xyn2)为对象，通过对Xyn2分子结构的分析，分别在其两个不稳定区-N端(N-terminal)与β核心(β-core)的连接区以及α螺旋(α-helix)与β-core之间的连接区，引入二硫键成功获得了耐热突变木聚糖酶Ⅱ:Xyn2C14-52以及Xyn2C59-149，并进一步构建了能分泌表达该重组酶的毕赤酵母基因工程菌，研究其酶学性质以及适宜的产酶条件。主要研究内容及结果如下:
试验一:里氏木霉Xyn2的克隆、序列分析及突变基因的设计
以木聚糖诱导培养的里氏木霉Rut C-30总RNA为模板，通过RT-PCR反应获得其cDNA，并以此为模板通过一对Xyn2特异性引物成功扩增得到大小符合预期(～600bp)的木聚糖酶Ⅱ基因(Xyn2)片段。通过TA克隆方法成功连接至pMD19-T(Simple)质粒，得到重组克隆质粒T-Xyn2。经DNA测序与比对检测确认与NCBI数据库中T.ressei xyn2序列一致。以木聚糖酶Ⅱ的氨基酸序列在蛋白质数据库(Protein Data Base)进行序列比对，得到了氨基酸序列与木聚糖酶Ⅱ完全匹配的编码为3akq的蛋白质三位结构模板-属于典型的糖苷水解家族11(GHfamily11)蛋白。对木聚糖酶Ⅱ三位结构3akq进行动力学参数(B-factor)分析，发现位于N端(N-terminal)与β核心连接区的分子相对其周围区域的分子拥有较高的B-factor指数，是Xyn2蛋白质分子中的不稳定区域(Unstable Domain)。因此，通过将Xyn2第14及52位氨基酸突变为半胱氨酸(Cys)成功在该不稳定区域设计引入二硫键并获得突变基因Xyn2C14-52.同时，在前人的基础上对α螺旋区的稳定性改造进一步优化，通过将Xyn2分子低59及149位氨基酸突变为半胱氨酸，成功的在α螺旋区与更加稳定的β核心区之间设计引入二硫键获得突变基因Xyn2C59-149。通过分子交互性分析，发现Xyn2突变基因中的半胱氨酸(Cys)对Cys14-52以及Cys59-149均具有形成二硫键的空间可行性。因此本研究通过基因定点突变技术(Site-direct Mutagenesis)成功获得了编码预期突变氨基酸的突变Xyn2基因:Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。
试验二:Xyn2及其突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质
分别将Xyn2及其突变基因Xyn2C12-52及Xyn2C59-149克隆至E.coli高效表达载体pET32a(+)上，得到重组表达载体pET32-Xyn2、pET32-Xyn2C14-52、pET32-Xyn2C59-149。随后通过热击法转入宿主菌后并成功诱导表达得到了分子量约37kDa的可溶重组Xyn2、Xyn2C14-52以及Xyn2C59-149蛋白，其比酶活分别为617.31、313.97、524.17U/mg。相对于野生型Xyn2，在引入二硫键后，突变体的耐热和耐酸碱性能均有提高。在70℃、pH6.0的条件下孵育10分钟后，野生型Xyn2几乎失去其所有酶活（残余相对酶活力为1.03％），而含有二硫键的突变体Xyn2C14-52以及Xyn2C59-149仍保留有超过20％的相对酶活力。同时Xyn2C14-52及Xyn2C59-149的耐酸能力(pH＜7.0)均优于Xyn2，Xyn2C14-52的耐碱性能力则优于Xyn2及Xyn2C59-149。二硫键的引入仅降低了Xyn2C14-52的最适反应温度(60℃将至50℃)，对Xyn2C59-149的最适温度，Xyn2C14-52及Xyn2C59-149的最适pH均无影响。
试验三:Xyn2及其突变基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质分析
本研究为了进一步提高重组酶表达水平，分别将Xyn2及其突变基因Xyn2C14-52及Xyn2C59-149经P.pastoris穿梭质粒pPICZαA整合至P.pastoris x-33基因组上。在甲醇的诱导下成功分泌表达得到大小约为20kDa的目的蛋白Xyn2、Xyn2C14-52及Xyn2C59-149，其比酶活分别为1037.92、470.73、934.17U/mg。毕赤酵母表达产物与大肠杆菌表达产物具有相似的性质，本研究中，二个设计的二硫键的引入位置均能提高Xyn2的耐热及耐酸碱能力。由于真核生物对蛋白质的修饰特性，本研究中实际表达获得了糖基化修饰的木聚糖酶。对糖基化的分析发现，二硫键的引入不影响Xyn2的糖基化位点，同时糖基化能够提高蛋白的其耐热性能。
试验四:木聚糖酶Xyn2C59-149表达条件优化及其稳定性研究
本研究从两个Xyn2突变体中选取了最具应用价值的Xyn2C59-149作为表达条件优化和体内酶学性质的分析。通过响应面实验设计，发现影响Xyn2C59-149在毕赤酵母中表达的最主要因素是甲醇浓度，而实验中的温度与pH范围对毕赤酵母的影响没有显著性。本研究通过对表达条件的优化，在最优的表达条件下（甲醇浓度为1.28％、pH为5.93、温度为29.43），成功的将Xyn2C59-149重组毕赤酵母基因工程菌的表达量提高到了420.1U/ml。同时通过木聚糖酶Xyn2C59-149的体内酶学性质研究表明，在42天肉鸡日粮中添加5000U/kg的木聚糖酶后，在十二指肠、空肠、回肠分别残余2297、2472、1680U/kg酶活。这表明，Xyn2C59-149对动物消化道内复杂的理化环境以及蛋白酶的作用具有良好的耐受性，符合饲料酶制剂的应用需求。
综上所述，本研究通过基因定点突变技术设计得到耐热木聚糖酶基因Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。并通过构建其重组大肠杆菌工程菌，诱导表达获得突变木聚糖酶Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。与原酶Xyn2比较，突变木聚糖酶Xyn2C14-52、Xyn2C59-149拥有更好的耐热及耐酸碱性能。同时与大肠杆菌表达系统相比，通过构建毕赤酵母的重组基因工程菌不仅大大降低了重组蛋白的纯化难度，而且还提高了Xyn2C14-52与Xyn2C59-149生物活性（酶活力、底物结合能力、耐热性能）。其中Xyn2C59-149的酶学性质更加符合工业应用需求。同时本研究将耐热木聚糖酶Xyn2C59-149饲喂肉鸡，发现Xyn2C59-149对肉鸡消化道内环境具有较好的耐受能力。因此在本研究中，对Xyn2的改造不仅提供了新的改造思路，揭示了部分蛋白质结构与功能的关系，还获得了一株具有工业应用价值的耐热木聚糖酶Xyn2C59-149。
试验一:里氏木霉Xyn2的克隆、序列分析及突变基因的设计
以木聚糖诱导培养的里氏木霉Rut C-30总RNA为模板，通过RT-PCR反应获得其cDNA，并以此为模板通过一对Xyn2特异性引物成功扩增得到大小符合预期(～600bp)的木聚糖酶Ⅱ基因(Xyn2)片段。通过TA克隆方法成功连接至pMD19-T(Simple)质粒，得到重组克隆质粒T-Xyn2。经DNA测序与比对检测确认与NCBI数据库中T.ressei xyn2序列一致。以木聚糖酶Ⅱ的氨基酸序列在蛋白质数据库(Protein Data Base)进行序列比对，得到了氨基酸序列与木聚糖酶Ⅱ完全匹配的编码为3akq的蛋白质三位结构模板-属于典型的糖苷水解家族11(GHfamily11)蛋白。对木聚糖酶Ⅱ三位结构3akq进行动力学参数(B-factor)分析，发现位于N端(N-terminal)与β核心连接区的分子相对其周围区域的分子拥有较高的B-factor指数，是Xyn2蛋白质分子中的不稳定区域(Unstable Domain)。因此，通过将Xyn2第14及52位氨基酸突变为半胱氨酸(Cys)成功在该不稳定区域设计引入二硫键并获得突变基因Xyn2C14-52.同时，在前人的基础上对α螺旋区的稳定性改造进一步优化，通过将Xyn2分子低59及149位氨基酸突变为半胱氨酸，成功的在α螺旋区与更加稳定的β核心区之间设计引入二硫键获得突变基因Xyn2C59-149。通过分子交互性分析，发现Xyn2突变基因中的半胱氨酸(Cys)对Cys14-52以及Cys59-149均具有形成二硫键的空间可行性。因此本研究通过基因定点突变技术(Site-direct Mutagenesis)成功获得了编码预期突变氨基酸的突变Xyn2基因:Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。
试验二:Xyn2及其突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质
分别将Xyn2及其突变基因Xyn2C12-52及Xyn2C59-149克隆至E.coli高效表达载体pET32a(+)上，得到重组表达载体pET32-Xyn2、pET32-Xyn2C14-52、pET32-Xyn2C59-149。随后通过热击法转入宿主菌后并成功诱导表达得到了分子量约37kDa的可溶重组Xyn2、Xyn2C14-52以及Xyn2C59-149蛋白，其比酶活分别为617.31、313.97、524.17U/mg。相对于野生型Xyn2，在引入二硫键后，突变体的耐热和耐酸碱性能均有提高。在70℃、pH6.0的条件下孵育10分钟后，野生型Xyn2几乎失去其所有酶活（残余相对酶活力为1.03％），而含有二硫键的突变体Xyn2C14-52以及Xyn2C59-149仍保留有超过20％的相对酶活力。同时Xyn2C14-52及Xyn2C59-149的耐酸能力(pH＜7.0)均优于Xyn2，Xyn2C14-52的耐碱性能力则优于Xyn2及Xyn2C59-149。二硫键的引入仅降低了Xyn2C14-52的最适反应温度(60℃将至50℃)，对Xyn2C59-149的最适温度，Xyn2C14-52及Xyn2C59-149的最适pH均无影响。
试验三:Xyn2及其突变基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质分析
本研究为了进一步提高重组酶表达水平，分别将Xyn2及其突变基因Xyn2C14-52及Xyn2C59-149经P.pastoris穿梭质粒pPICZαA整合至P.pastoris x-33基因组上。在甲醇的诱导下成功分泌表达得到大小约为20kDa的目的蛋白Xyn2、Xyn2C14-52及Xyn2C59-149，其比酶活分别为1037.92、470.73、934.17U/mg。毕赤酵母表达产物与大肠杆菌表达产物具有相似的性质，本研究中，二个设计的二硫键的引入位置均能提高Xyn2的耐热及耐酸碱能力。由于真核生物对蛋白质的修饰特性，本研究中实际表达获得了糖基化修饰的木聚糖酶。对糖基化的分析发现，二硫键的引入不影响Xyn2的糖基化位点，同时糖基化能够提高蛋白的其耐热性能。
试验四:木聚糖酶Xyn2C59-149表达条件优化及其稳定性研究
本研究从两个Xyn2突变体中选取了最具应用价值的Xyn2C59-149作为表达条件优化和体内酶学性质的分析。通过响应面实验设计，发现影响Xyn2C59-149在毕赤酵母中表达的最主要因素是甲醇浓度，而实验中的温度与pH范围对毕赤酵母的影响没有显著性。本研究通过对表达条件的优化，在最优的表达条件下（甲醇浓度为1.28％、pH为5.93、温度为29.43），成功的将Xyn2C59-149重组毕赤酵母基因工程菌的表达量提高到了420.1U/ml。同时通过木聚糖酶Xyn2C59-149的体内酶学性质研究表明，在42天肉鸡日粮中添加5000U/kg的木聚糖酶后，在十二指肠、空肠、回肠分别残余2297、2472、1680U/kg酶活。这表明，Xyn2C59-149对动物消化道内复杂的理化环境以及蛋白酶的作用具有良好的耐受性，符合饲料酶制剂的应用需求。
综上所述，本研究通过基因定点突变技术设计得到耐热木聚糖酶基因Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。并通过构建其重组大肠杆菌工程菌，诱导表达获得突变木聚糖酶Xyn2C14-52、Xyn2C59-149。与原酶Xyn2比较，突变木聚糖酶Xyn2C14-52、Xyn2C59-149拥有更好的耐热及耐酸碱性能。同时与大肠杆菌表达系统相比，通过构建毕赤酵母的重组基因工程菌不仅大大降低了重组蛋白的纯化难度，而且还提高了Xyn2C14-52与Xyn2C59-149生物活性（酶活力、底物结合能力、耐热性能）。其中Xyn2C59-149的酶学性质更加符合工业应用需求。同时本研究将耐热木聚糖酶Xyn2C59-149饲喂肉鸡，发现Xyn2C59-149对肉鸡消化道内环境具有较好的耐受能力。因此在本研究中，对Xyn2的改造不仅提供了新的改造思路，揭示了部分蛋白质结构与功能的关系，还获得了一株具有工业应用价值的耐热木聚糖酶Xyn2C59-149。