背景目的：大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。随着国民饮食结构的变化,精细食物和高蛋白、高脂肪食物的摄入不断增多,大肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前对大肠癌的治疗采取的是一种包括手术、放疗、化疗以及生物、免疫治疗等在内的综合治疗,但不管采用哪种手段,长期生存率和生活质量仍不理想。因此,近年来人们正在积极寻求预防大肠癌的方法。研究表明大肠癌的发生与饮食因素有关,同时饮食成份又在大肠癌的预防中发挥着重要作用。所以,饮食干预可能是最经济有效的大肠癌预防手段之一。膳食中存在的天然抗癌成分与其他防癌、抗癌药相比具有安全性和实用性,也更易为人体所接受等优点,近年来受到国内外学者的广泛关注。流行病学研究发现,经常食用辣根、甘蓝、花椰菜、卷心菜等十字花科蔬菜能降低人类前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌和结肠癌等的患病危险。芥菜籽(mustard seed, MS)又名芥子,是十字花科芸苔属植物芥菜的种子,含有芥子油、芥子黏液、多糖和β-谷甾醇等活性成分,其加工的产品芥末油和芥末粉是我们生活中常用的调味品。较多的研究发现,芥菜籽具有防癌抗癌的活性。在苯并芘[B(a)P]诱导小鼠胃癌和甲基胆蒽(MCA)诱导小鼠宫颈癌模型中,实验组给予含5%芥菜籽的饲料,对照组为标准饲料,结果实验组胃癌发生率降低28%,宫颈癌发生率降低60%。在芥菜籽含有的活性成份中,含15%芥菜籽油的饲料能使氧化偶氮甲烷(AOM)诱导大鼠结肠癌发病率降低40%；芥菜籽黏液能使AOM诱发SD大鼠结肠癌癌前病变异常隐窝的数目减少21%；β-谷甾醇亦能通过增强免疫监视功能来抑制多种肿瘤的转移；植物多糖在机体免疫调节、增强细胞抗肿瘤活性等方面具有重要的生物活性,不但能促进T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞的功能,还能促进白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的产生。芥菜籽能否作为一种安全、有效的预防剂应用于大肠癌的预防,目前这方面的研究不多,同时芥菜籽抗癌的作用机制仍不清楚。机体肿瘤的发生发展与免疫力改变密切相关,在大肠癌患者中,普遍存在免疫抑制现象,主要是免疫系统不能有效识别、排斥和消灭肿瘤细胞。机体抗肿瘤免疫包括体液免疫和细胞免疫两方面。细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中起主要作用。在控制具有免疫性肿瘤细胞的生长中,T细胞介导的免疫应答反应起重要作用。抗原致敏的T细胞能特异地杀伤、溶解带有相应抗原的肿瘤细胞,并受MHC限制。包括MHCⅠ类抗原限制的CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和MHCⅡ类抗原限制的CD4+辅助性T细胞(TH)。CD8+CTL既能直接杀伤肿瘤细胞又能通过分泌淋巴因子如Y干扰素、淋巴毒素等间接地杀伤肿瘤细胞。近年来,通过体内外实验证实部分CD8+T细胞同样具有免疫调节功能,根据其分泌细胞因子的不同,分为分泌Ⅰ类因子的T细胞(T1)和分泌Ⅱ类因子T细胞(T2)。研究发现,许多疾病,包括感染性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病等均可出现T1、T2亚群的异常,特别是恶性肿瘤与T1、T2亚群的关系,已日益引起人们的重视,T1/T2的比率降低,抑制机体的免疫功能,有利于恶性肿瘤的进展。近年研究发现CD4+CD25+FOXP3+细胞是具有免疫调节功能的T细胞亚群,研究表明,在胃癌、宫颈癌、肺癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤组织中存在高比例的CD4+CD25+Treg细胞,提示肿瘤的发生与免疫逃逸机制密切相关。此外,在肿瘤免疫的效应阶段,肿瘤组织中淋巴细胞杀伤功能主要是通过细胞与细胞相互接触的方式来实现,并由穿孔素和颗粒酶等效应分子来进一步启动靶细胞凋亡通路,引起靶细胞死亡。动物肿瘤模型是目前研究肿瘤病因、预防、早期诊断和治疗的重要工具。大肠癌常用的动物模型是化学致癌,其中研究最多和应用最广泛的大肠特异性致癌物是1,2-二甲基肼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)。1,2-二甲肼是一种强力诱癌剂,其诱导啮齿类动物大肠癌除了具有较高的器官特异性和诱癌率外,它所诱发的大肠癌在组织学的形态发生、发生部位、生物化学、抗原免疫原性及生物学行为等方面都与人类相似,目前己经广泛应用于大肠癌发生、预防、治疗的相关研究。基于以上研究背景,本实验以1,2-二甲肼(DMH)化学诱导的大鼠大肠癌为研究对象,初步研究芥菜籽对DMH化学诱导的大鼠大肠癌的预防作用,观察胸腺指数和脾指数的变化情况；观察芥菜籽对大鼠体内细胞免疫、细胞因子、穿孔素表达水平的影响及脾淋巴细胞在体外对人结直肠癌细胞系SW480细胞生长的抑制作用,从免疫功能与肿瘤发生的角度探讨芥菜籽预防大肠癌发生的作用机制,为芥菜籽应用于大肠癌防治的可行性探讨奠定基础。材料和方法：1.用1,2-二甲肼(DMH)诱导雄性Wistar大鼠建立大肠癌模型,48只大鼠随机分4组,每组12只：(1)正常对照组(Normal control):(2)成瘤组(DMH组)；(3)低剂量干预组(DMH+5%MS)；(4)高剂量干预组(DMH+7.5%MS)。从实验第1周开始,成瘤组、低剂量干预组和高剂量干预组每周腹腔注射1次DMH,剂量为30mg/kg.wt),连续20周,正常对照组大鼠则注射相同体积的0.9%的NaCl溶液。正常对照组和成瘤组常规饲养,低剂量干预组和高剂量干预组在诱癌的同时分别给予含5%和7.5%芥菜籽的饲料喂养直至32周实验结束时。2.观察各组大鼠的一般状态,如摄食及饮水情况、营养状况、体重、活动状态、毛色、光泽度变化、大便性状等方面的改变情况。实验32周时处死大鼠,留取血清、脾脏、肝脏、胸腺及肠系膜淋巴结,分离大肠,预冷生理盐水冲洗肠内容物；3.观察记录各组大鼠肿瘤发生的部位、数目和大小,计算各组大鼠肿瘤发生率、平均肿瘤数和抑瘤率,同时观察其它脏器有无转移灶发生；4.肿瘤组织、肝脏和肠系膜淋巴结常规固定脱水,石蜡包埋切片,H.E染色观察,确定肿瘤的组织学类型及肿瘤转移情况；5.记录各组大鼠胸腺、脾脏重量,按下列公式计算胸腺指数和脾指数：胸腺指数(mg/g)=胸腺重量(mg)/大鼠重量(g),脾指数(mg/g)=脾脏重量(mg)/大鼠重量(g)；6.流式细胞(FCM)术检测各组大鼠脾脏中MHCⅠ+、MHCⅡ+、CD4+、CD4+、CD8+、CD25+、Foxp3+细胞的比率；7.运用多功能液相芯片分析系统(luminex200)检测各组大鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α的含量；8. Western blot检测各组大鼠脾脏组织中穿孔素表达水平；9.运用MTT法检测各组大鼠脾淋巴细胞对人结直肠癌细胞系SW480细胞生长的抑制作用。结果1.实验终末期,DMH模型组大鼠出现消瘦衰竭、厌食、脱毛、血便等表现,其中有1只大鼠伴有腹水。实验开始时,各组大鼠平均体重经统计学比较无明显差异(F=0.614,P=0.610),实验终点时,各组大鼠平均体重经统计学比较差异有显著性(F=7.683,P=0.000),其中DMH模型组大鼠平均体重比MS干预组及正常对照组均降低,差异有显著性(P<0.01)。整个实验过程中,各实验组间大鼠平均增加的体重经统计学比较差异有显著性(F=8.129,P=0.000),其中MS干预组大鼠增加的体重最多,其次是正常对照组,体重增加最少的是DMH模型组。2.各组大鼠平均胸腺指数经统计学比较差异有显著性(F=2.829,P=0.049),其中5%MS和7.5%MS组大鼠胸腺指数分别为0.84±0.13mg/g和0.88±0.10mg/g,与DMH组(0.73±0.13mg/g)相比均增加,差异有显著性(P<0.05),且7.5%MS组较5%MS高。各组大鼠平均脾指数经统计学比较差异有显著性(F=3.016,P=0.040),其中5%MS和7.5%M8组大鼠脾指数分别为2.34±0.49mg/g和2.38±0.52mg/g,与DMH组(1.86±0.49mg/g)相比均增加,差异有显著性(P<0.05),且7.5%MS组较5%MS高；3.正常对照组大鼠无肿瘤发生。DMH模型组大鼠大肠腺癌发生率为83.33%(10/12),大肠腺瘤发生率为16.67%(2/12),总大肠肿瘤发生率为100%(12/12),肝及淋巴结转移率58.33%(7/12)。5%MS和7.5%MS组大鼠大肠腺癌的发生率与DMH组相比分别降低了58.33%、75%,三组之间相比差异有显著性(χ2=15.662,P=0.000<0.01)。5%MS和7.5%MS组大鼠大肠肿瘤肠系膜淋巴结及肝转移率分别降低了41.66%、50%,三组之间相比差异有显著性(χ2=8.585,P=0.008<0.14)。总肿瘤发生率分别降低了66.67%、41.70%,三组之间相比差异有显著性(χ2=9.687,P=0.008<0.01)。MS干预组大鼠大肠腺瘤的发生率与DMH组相比无显著性差异(χ2=1.833,P=0.400)。各组大鼠大肠总肿瘤发生率经统计学比较差异有显著性(χ2=9.687,P=0.008),与DMH模型组比较,5%MS和7.5%MS干预组大肠总肿瘤发生率分别减少了33.30%、58.30%。各实验组大鼠大肠荷瘤数经统计学比较差异有显著性(F=7.835,P=0.002),与DMH模型组比较,5%MS和7.5%MS干预组大鼠大肠荷瘤数显著减少,有显著性差异(P<0.01),其中7.5%MS干预较5%MS干预组减少更多。4.各组大鼠脾中MHCⅠ阳性细胞比率相比差异有显著性(F=2.950,P=0.043),其中5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中MHCⅠ阳性细胞比率(分别为74.55±5.31%、74.55±9.91%)与DMH组(66.47±8.54%)相比均显著增加,差异具有显著性(P<0.05)。5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中MHCⅡ阳性细胞比率分别为24.40±5.13%、23.56±6.44%,DMH组为31.09±8.80%,各实验组大鼠脾中MHCⅡ阳性细胞比率经统计学比较差异有显著性(F=3.359,P=0.027)。MS干预组之间、MS干预组与正常对照组之间(MHC I、MHCⅡ阳性细胞比率分别为69.33±7.89%、27.35±4.53%)及DMH组与正常对照组之间大鼠脾脏中MHCⅠ、MHCⅡ阳性细胞比率均无显著性差异(P>0.05)。5.5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中B220+MHCⅠ+细胞的比率分别为27.53±6.53%、36.07±8.90%,DMH组为16.81±4.53%,各实验组之间比较差异有显著性(F=15.574,P=0.000),其中5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中B220+MHCⅠ+细胞比率与DMH组相比均增加,差异具有显著性(P<0.01)。各实验组大鼠脾中CDllc+MHC I+性细胞比率经统计学比较差异有显著性(F=13.739,P=0.000),其中5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中CDllc+MHC I+细胞占脾总淋巴细胞的比率分别30.41±6.97%、30.59±5.99%,与DMH模型组(19.76±3.78%)相比均显著增加,差异具有显著性(P<0.01)。7.5%MS组B220+MHC I+、CDllc+MHC I+细胞比率和5%MS组CDllc+MHC I+细胞比率与正常对照组相比增加,差异有显著性(P<0.01),正常对照组大鼠脾脏中B220+MHCⅠ+细胞比率与DMH组相比也增加,差异有显著性(P<0.01)。6.各组大鼠脾中B220+MHCⅡ+阳性细胞比率经统计学比较差异有显著性(F=2.904,P=0.045),其中7.5%MS干预大鼠脾脏中B220+MHCⅡ+细胞比率为19.27±6.48%,与DMH模型组(26.07±4.62%)相比降低,差异有显著性(P<0.05)。各组大鼠脾中CDllc+MHCⅡ+阳性细胞比率经统计学比较差异有显著性(F=3.133,P=0.035),其中7.5%MS干预组大鼠脾脏中CDllc+MHCⅡ+细胞占脾总淋巴细胞的比率为3.20±1.33%,与DMH组(1.90±1.01%)相比增加,差异有显著性(P<0.05)7.大鼠脾脏中CD8单阳性细胞比率在正常对照组、DMH模型组、5%MS和7.5%MS干预组分别为18.15±6.81%、13.09±3.40%、20.49±4.29%和18.41±4.66%,经统计学比较各组之间差异有显著性(F=4.819,P=0.005),其中正常对照组、5%MS和7.5%MS干预组与DMH模型组相比均增加,差异有显著性(P<0.05),而MS干预组之间及其与正常对照组间相比无显著性差异(P>0.05)。各组大鼠脾脏中CD4单阳性细胞与CD8单阳性细胞比值经统计学比较差异有显著性(F=6.070,P=0.002),其中正常对照组、5%MS和7.5%MS干预组大鼠脾脏中CD4+/CD8+值分别为2.04±0.56、1.87±0.38和1.91±0.67,与DMH模型组的2.81±0.81相比降低,差异有显著性(P<0.01)8.大鼠脾脏中CD4+CD25+FOXP3+细胞在DMH模型组、5%MS和7.5%MS干预组的比率分别为：2.70±1.01%、1.59±0.80%和1.52±0.86%,经统计学比较各组之间差异有显著性(F=4.932,P=0.000),其中5%MS和7.5%MS干预组与DMH模型对照组相比均显著减少,差异有显著性(P<0.01),正常对照组与DMH组相比也减少,差异有显著性(P<0.05)9.各组大鼠血清中IL-2的含量经统计学比较差异有显著性(F=3.526,P=0.022),其中7.5%MS干预组大鼠血清中IL-2的含量为57.50±8.76pg/ml与DMH模型组的48.68±6.33pg/ml相比增加,差异有显著性(P<0.05)；各组大鼠血清中IL-4和IL-10的含量经统计学比较差异均有显著性(FIL-4=4.041,PIL-4=0.013；FIL-10=6.285,PIL-10=0.001),其中IL-4和IL-10的含量在7.5%MS干预组大鼠血清中分别为2.41±0.77pg/ml和39.56±7.53pg/ml,与DMH模型组的4.97±3.29pg/ml和49.79±8.71pg/ml相比明显减少,差异有显著性(P<0.01)。各组大鼠血清中TNF-a、IFN-r和IL-12的含量经统计学比较差异均有显著性(FTNF-a=3.911,PTNF-a=0.015；FIFN-r=3.334,PIFN-r=0.028;FIL-12=3.082,PIL-12=0.037),其中在5%MS干预组大鼠血清中细胞因子TNF-a、IFN-r和IL-12的含量分别为16.56±7.95pg/ml、15.28±7.89 pg/ml和22.02±5.39pg/ml,与DMH模型组的10.02±1.41pg/ml、7.52±4.32 pg/ml和15.03±5.53相比明显增加,差异有显著性(P<0.05)。在5%MS干预组血清中IL-10因子的含量为36.88±3.84pg/ml,与DMH模型组的49.79±8.71pg/ml相比则明显减少,差异有显著性(P<0.01)。10.与DMH组相比,7.5%MS干预组大鼠脾组织表达高水平的穿孔素；11.各组大鼠脾淋巴细胞对SW480细胞生长的抑制比较差异有显著性(F=16.650,P=0.001),其中5%和7.5%MS干预组大鼠淋巴细胞对SW480细胞生长的抑制率分别为61.43±9.62%和76.13±5.94%,与DMH模型组相比分别增加了29.06±6.55%和43.76±2.87%,差异有显著性(P<0.01)。正常对照组大鼠脾淋巴细胞对SW480细胞生长的抑制率为48.17±10.68%,与DMH模型对照组相比增加了15.80±7.61%,而与7.5%MS干预组相比则减少了27.96±4.74%,差异有显著性(P<0.05)。结论1.芥菜籽对DMH诱导的大鼠大肠癌具有化学预防作用,能明显降低DMH诱导的大鼠大肠癌发生率和减少大鼠的平均肿瘤数和肠系膜及肝脏转移率。随着芥菜籽浓度的增加,其预防大肠癌发生的作用明显增强。2.芥菜籽能增加大鼠的体重、胸腺指数和脾指数,增强大鼠体质、改善大鼠的免疫功能。3.在DMH诱导肿瘤过程中,芥菜籽能增加表达MHCI类分子细胞水平,激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞；提高实验大鼠机体CD8+淋巴细胞的水平和降低CD4/CD8的比例,维持T细胞亚群间的平衡,增强机体细胞免疫功能,提高淋巴细胞活性；降低CD4+CD25+Foxp3+细胞水平,使其抑制其它免疫细胞的增殖的能力减弱；纠正DMH模型组的Thl向Th2免疫偏移,从而增强机体的细胞免疫功能；增加穿孔素的水平,使肿瘤抵抗细胞毒性效应细胞的攻击能力减弱。其预防大肠癌的作用机制可能与它的免疫调节作用有关,通过增强机体免疫细胞功能,减弱肿瘤细胞对胞毒性效应细胞的攻击能力。