【摘 要】
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菜豆富含蛋白质、矿物质和维生素等营养物质,是人们喜食的主要蔬菜作物之一。然而,因不当食用菜豆导致的中毒事件在世界各地时有发生。究其原因,主要是烹饪过程中高温及其持续时间不足以彻底破坏菜豆所含的植物血球凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin,PHA）等抗营养成分所引起的。近些年来,对于菜豆PHA的相关研究成为热点,聚焦于研究PHA蛋白和亚基的结构以及功能上,但从菜豆种质着
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菜豆富含蛋白质、矿物质和维生素等营养物质,是人们喜食的主要蔬菜作物之一。然而,因不当食用菜豆导致的中毒事件在世界各地时有发生。究其原因,主要是烹饪过程中高温及其持续时间不足以彻底破坏菜豆所含的植物血球凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin,PHA）等抗营养成分所引起的。近些年来,对于菜豆PHA的相关研究成为热点,聚焦于研究PHA蛋白和亚基的结构以及功能上,但从菜豆种质着手研究PHA的合成以及含量水平的分子合成调控机制还鲜见报道。本研究以不同PHA水平的菜豆种质,开花后处于不同发育阶段的豆荚为材料,进行PHA水平测定和转录组测序,比对后,筛选了候选调控因子,并实施部分功能验证,以探寻菜豆PHA的合成调控通路并揭示菜豆豆荚PHA合成水平的分子调控机制,对实施更低或者更高PHA水平的菜豆种质创新有参考价值,将有利于从源头上根除菜豆食用致毒隐患,并为菜豆PHA人工制备等的提供参考。研究内容和结果如下:1)实验材料的种植和取样:种植了包括测序菜豆材料SJ-0053（高PHA水平）和SJ-0119（低PHA水平）在内的共12种商品荚PHA含量高低不同的材料,并在豆荚的不同发育时期（开花后4d,6 d,8 d,10 d,12 d,14 d和16 d）进行了取样,用于测PHA含量和提取RNA进行q PCR验证。2)PHA含量检测:对SJ-0053和SJ-0119两个高低PHA水平的菜豆材料不同时期的豆荚样品,用PBS提取蛋白的方法进行PHA提取,并用兔红细胞凝血法进行PHA含量测量。得到两个材料随着豆荚发育,豆荚中PHA含量的变化情况,即豆荚中PHA的累积主要发生在开花10天后,且此后SJ-0053的豆荚PHA含量逐渐远超SJ-0119,此前SJ-0119豆荚PHA含量略高于SJ-0053。3)筛选转录因子:通过对前期SJ-0053和SJ-0119两个材料转录组数据和PHA含量数据进行整理分析（此处取开花后第6d,8 d,10 d,12 d,14 d和16 d的荚）结合样品间的基因差异表达分析,以及基因表达量和相应PHA含量的关联分析,筛选出了9个可能与PHA表达调控相关的转录因子,同两个用于相对定量的内参基因,一同设计出11对引物。4)转录因子验证:不同时期不同材料的豆荚样本,通过提取RNA,进行c DNA文库构建和q PCR,并分析数据,比对之前的筛选结果,验证转录因子与PHA表达调控的相关性。初步验证了3个上调转录因子,即ERF1、WRKY22;1个下调转录因子,即WRKY33;和2个与PHA含量的变化规律较吻合的两个转录因子,即SKP1,CBF3D和MYC2。本研究对菜豆豆荚PHA含量性状进行了表型研究、转录组测序、转录调控因子筛选和q PCR验证。初步探索了不同PHA水平菜豆材料豆荚发育过程中,PHA含量的变化规律。初步验证了可能与PHA合成有关的6个转录因子,其中3个上调,1个下调,2个可能参与反馈调节。这些对揭秘菜豆豆荚PHA合成的遗传规律和分子调控机制提供了一定的参考价值。
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