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纳豆（natto）是日本的传统食品，由纳豆芽孢杆菌（Bacillussubtilis natto）发酵大豆而成，具有较高的营养价值和保健功能。但在纳豆的发酵过程中，纳豆芽孢杆菌代谢产生大量的氨，影响了其风味。本课题组从商品纳豆中分离得到纳豆芽孢杆菌CGMCC No.2801，其发酵的纳豆产品中氨含量达347.7±24.31mg/kg。改造纳豆芽孢杆菌的代谢途径可以有效地改善纳豆的风味。纳豆芽孢杆菌代谢产氨的主要途径是转氨作用和谷氨酸脱氢酶（GDH）催化的联合脱氨基作用以及尿素酶催化的尿素降解作用。在纳豆芽孢杆菌中，rocG基因和ure基因分别编码GDH和尿素酶。因此，利用基因工程技术，对GDH和尿素酶的编码基因进行敲除或定点突变，应是解决这一问题的有效途径。本实验以B. subtilis168序列设计特异性引物，以分离株CGMCC No.2801为模板，PCR克隆了rocG和ure基因。对比CGMCC No.2801及9株芽孢杆菌属菌株rocG基因和ure基因编码区的GC含量、GDH和尿素酶的氨基酸序列可知，这两种酶在基因水平和氨基酸水平上均表现出较高的同源性和保守性，说明了rocG和ure基因在编码合成GDH和尿素酶时，稳定性较高，只有在基因水平上进行改造才能改变或降低酶活，因此定点突变或基因敲除应是合理的降低产氨量的方案之一。基于rocG基因和ure基因碱基序列构建进化树，分析其亲缘关系可知， CGMCC No.2801的GDH和尿素酶在进化上更接近于枯草芽孢杆菌，且与B.subtilis168的同源性最高，故选择完成全基因组测序的B. sbutilis168为参考菌株，获得分离株rocG和ure基因的非编码区序列及敲除载体的上下游同源臂。NCBI比对及Mega5.05非编码区序列分析结果显示，CGMCC No.2801的rocG基因和ure基因的启动序列分别与原核微生物常见的-35区和-10区启动序列以及枯草芽孢杆菌σA启动序列基本相符。-35区和-10区启动序列以及枯草芽孢杆菌σA启动序列均为强启序列，可推测这两个基因的转录效率较高，因而纳豆芽孢杆菌可能在较短的时间内产生大量的GDH和尿素酶，催化产氨反应。分析了革兰氏阳性菌基因组整合质粒pMUTin4的多克隆位点（MCS）及rocG基因和ure基因上下游1,000bp旁邻序列的酶切位点，确定了可用于重组质粒构建的4个酶切位点，分别为Hind Ⅲ（AAGCTT），Xho Ⅰ（CTCGAG），Not Ⅰ（GCGGCCGC）和BamHⅠ（GGATCC）。分别根据B. subtilis168的序列和已报道的nisI基因的序列，设计特异性引物，并引入上述酶切位点。通过PCR方法，分别获得了抗性筛选基因nisI片段和2个靶基因的上下游旁邻片段。经多次酶切酶连，将上游旁邻片段、nisI和下游旁邻片段按次序克隆至pMUTin4中。限制性内切酶酶切图谱及测序结果显示成功构建了纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因的敲除载体pMUTin4-rocG::nisI和pMUTin4-ure::nisI。通过同源重组，该敲除载体可用于构建rocG基因和ure基因缺失型纳豆芽孢杆菌工程菌株，为生产低产氨量的纳豆产品奠定了基础。