论文部分内容阅读
目的应用改进的甲基化特异性PCR(MSP)法,即巢式甲基特异性PCR法(nested methylation specific PCR,nMSP)和DNA克隆测序检测六种恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态,鉴定出高甲基化的恶性血液病细胞株,并将其作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象;探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态及调节转录作用及其可能的机制。方法采用nMSP和DNA克隆测序检测CA46等细胞株P16基因甲基化状态,鉴定出恶性淋巴瘤CA46细胞株p16高甲基化的状态;采用SRB法以及生长曲线、克隆形成抑制率等方法检测AS2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用前后p16甲基化状态变化,RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达,利用流式细胞仪DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果(1)经过nMSP和克隆测序鉴定,我们确定恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因是高度甲基化的,可以用于逆转甲基化药物实验,As2O3作用72h后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转; (2)未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72h后p16基因表达增强,1.0μmol/L组、2.0μmol/L组和4.0μmol/L组p16基因表达阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),其差异有统计学意义(P<0.01);(3)与未处理组相比,As2O3作用72h后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响。(4)与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0-G1期细胞增加。结论1、巢式MSP法灵敏度高、特异性强,优于其他甲基化检测方