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目的糖尿病是一种以β细胞损伤和胰岛素抵抗为特征的慢性代谢性疾病。糖尿病的发生与细胞脂质过氧化所诱发的铁死亡密切相关。间充质干细胞是一种拥有出色治疗潜力的细胞,其的旁分泌作用在治疗疾病的过程中发挥极其重要的作用,目前已有研究表明大鼠间充质干细胞(Rat-Bone Mesenchymal Stem Cells,R-BMSC)和人脱落乳牙干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)在人体内均具有恢复糖尿病患者胰岛素分泌的能力,但是其作用机制并不明确。本课题通过细胞共培养实验研究间充质干细胞对STZ(Streptozotocin)损伤的β细胞的保护作用及其机制。方法第一节:间充质干细胞对STZ损伤的β细胞生长和功能的影响作用以最适浓度的STZ和干细胞处理INS-1细胞,用MTT实验检测间充质干细胞对INS-1细胞的生长活性作用。通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验收集细胞分泌的上清液,然后用ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)检测胰岛素浓度,分析间充质干细胞对β细胞胰岛素分泌功能的影响。用流式细胞术检测间充质干细胞周期,并且用Western blot检测周期蛋白Cyclin B的表达量。第二节:间充质干细胞缓解由STZ引起的β细胞铁死亡的研究1、间充质干细胞减轻由STZ引起的β细胞线粒体功能受损利用流式细胞术,通过JC-1探针检测β细胞线粒体膜电位变化,通过DCFH探针检测β细胞内活性氧(ROS,reactive oxygen species)变化。2、间充质干细胞降低STZ引起的β细胞脂质过氧化利用流式细胞术,通过BODIPY探针检测β细胞脂质活性氧变化,通过MDA检测试剂盒检-测β细胞内脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。3、间充质干细胞减轻由STZ引起的β细胞内铁死亡相关蛋白的改变以及积,还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽的改变(GSSG)的改变。利用GSH(glutathione)和GSSG(L-Glutathione)检测试剂盒检测β细胞内GSH及GSSG含量,并量化成GSH/GSSG比值,用Western blot检测细胞内GPX4(Glutathione peroxidase 4)、ACSL4(Acyl—Co A synthetase long-chain familymember 4)蛋白含量,用Ferro-Orange荧光染料检测细胞内游离Fe2+离子含量。第三节:间充质干细胞来源的外泌体缓解由STZ引起的β细胞铁死亡的研究用超高速离心法提取间充质干细胞外泌体对INS-1细胞,进行细胞周期、线粒体功能以及铁死亡相关指标的验证。利用流式细胞术,通过流式细胞术检测检测INS-1细胞周期变化,通过JC-1探针检测β细胞线粒体膜电位变化,通过DCFH探针检测β细胞内ROS的变化,通过BODIPY探针检测β细胞脂质活性氧变化,用Ferro-Orange荧光染料检测细胞内游离Fe2+离子含量。结果第一节:间充质干细胞阻止STZ对β细胞生长的阻滞作用并恢复β细胞胰岛素分泌功能经间充质干细胞共培养后,MTT实验观察到间充质干细胞共培养后的β细胞生长活性增强,STZ+间充质干细胞处理组β细胞生长活性较STZ处理组有所恢复。胰岛素分泌实验观察到间充质干细胞共培养后原本由于STZ作用受抑制的胰岛素分泌功能恢复。细胞周期观察到间充质干细胞共培养后原本由于STZ作用后阻滞的细胞周期G2期恢复。第二节:间充质干细胞抑制由STZ引起的β细胞铁死亡1、间充质干细胞抑制由STZ引起的β细胞线粒体功能下降间充质干细胞共培养后原本由于STZ引起的β细胞线粒体膜电位下降有所恢复,间充质干细胞共培养后原本由于STZ引起的β细胞内上升的ROS含量有所下降2、间充质干细胞抑制STZ引起的β细胞脂质过氧化间充质干细胞共培养后原本由STZ引起的β细胞内上升的脂质活性氧有所下降。间充质干细胞共培养后原本由STZ引起的β细胞内堆积的脂质过氧化物有所下降。3、间充质干细胞抑制由STZ引起的β细胞内铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4改变,抑制STZ引起的β内GSH/GSSG改变,抑制β细胞内游离Fe2+离子改变间充质干细胞共培养后原本STZ引起的β细胞内下降的GSH/GSSG比值有所恢复,间充质干细胞共培养后原本由STZ引起的β细胞内增加的游离Fe2+离子有所减少。间充质干细胞共培养后原本由STZ引起的β细胞内增加的ACSL4蛋白含量有所下降,GPX4蛋白含量由原本STZ所造成的下降有所上升。第三节:间充质干细胞来源的外泌体缓解由STZ引起的β细胞铁死亡超高速离心法分离后对间充质干细胞来源的胞外囊泡进行鉴定,符合外泌体的特征。用间充质干细胞来源的外泌体进行干预后原本由STZ引起的β细胞G2阻滞恢复,用间充质干细胞分泌的外泌体进行干预后原本由STZ引起的β细胞线粒体膜电位下降有所恢复,用间充质干细胞分泌的外泌体进行干预后原本由于STZ引起的β细胞内上升的ROS含量有所下降。间充质干细胞分泌的外泌体进行干预后原本由STZ引起的β细胞内上升的脂质活性氧有所下降。结论间充质干细胞抑制了由STZ引起的β细胞铁死亡通路,恢复受损β细胞的生长和胰岛素分泌功能。