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第一部分激活的Treg细胞减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤目的炎症反应在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中发挥重要作用,调节性T细胞(Treg)具有免疫调节作用并参与多种炎症性疾病的发生和发展,然而Treg细胞在MIRI中的作用未见报导。本实验的目的是探究Treg细胞对小鼠MIRI的影响。方法通过阻断冠状动脉左前降支30分钟恢复再灌注建立小鼠MIRI模型,流式细胞术检测再灌注后不同时间点(5分钟,6小时,24小时)心脏及脾脏中Treg细胞的浸润。免疫磁珠联合流式分选Foxp3-GFP knockin C57BL/6小鼠脾脏的CD4+GFP+ Treg细胞,经过体外anti-CD3/CD28抗体和IL-2刺激3天激活或直接用于过继转输;于手术前72小时腹腔注射小鼠anti-CD25单抗部分去除或使用DEREG小鼠选择性去除体内Treg细胞。再灌注后1天检测增加或去除Treg细胞后MIRI相关指标,包括血清肌钙蛋白及Evan’s blue和TTC双染检测梗死区和危险区面积;超声检测左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)以评价心功能。体外激活Treg细胞与新鲜分离的Treg细胞比较IL-10、TGF-β1 mRNA水平,腺苷产生能力及CCR5的表达增高。此外,建立MIRI模型,过继转输激活或新鲜分离的Treg细胞,于再灌注后6小时处死小鼠,免疫荧光及流式细胞术检测小鼠心脏Treg细胞浸润。结果心肌组织中Treg细胞比例在再灌注5分钟便呈增高趋势,但与假手术组(Sham)相比,各时间点Treg细胞比例的增高无统计学意义。然而再灌注后5分钟心肌组织中的Treg细胞浸润数目升高,之后持续上升,再灌注6小时到达高峰,24小时下降,但仍高于Sham组。与野生型小鼠(wild type)相比,DEREG组小鼠MIRI后心肌梗死面积增大,心功能进一步恶化,表现为梗死部分/危险区域(I/AAR)和肌钙蛋白增高,EF和FS均下降。而抗CD25单抗组与同型对照组相比,心肌梗死面积及心功能无明显改变。此外,与介质组(Vehicle)相比,外源性给予激活的Treg细胞组小鼠MIRI后梗死面积减小,心功能改善,而外源性给予新鲜分离的Treg细胞组小鼠心肌梗死面积及心功能均无明显改变。经体外激活的Treg细胞较新鲜分离的Treg细胞表达更多IL-10、TGF-β1及CCR5,并产生更多的腺苷。免疫荧光及流式分析结果提示MIRI后激活的Treg细胞具有更强地浸润至心肌局部的能力。结论Treg细胞在小鼠再灌注后心肌组织中浸润增多。Anti-CD25单抗部分去除Treg细胞或过继转输新鲜分离的Treg细胞对MIRI没有影响。而使用DEREG小鼠选择性完全去除小鼠体内Treg细胞加重MIRI,给予体外激活的Treg细胞则减轻MIRI,说明激活的Treg细胞在MIRI中发挥保护作用。此外,激活的Treg细胞较新鲜分离的Treg细胞有更强的抑制功能及迁移浸润能力。第二部分Treg细胞通过CD39在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用目的Treg细胞主要通过分泌调节性细胞因子(IL-10和TGF-β1)及细胞接触机制发挥免疫调节作用。此外,Treg细胞表面的CD39和CD73分子可以完成ATP到腺苷的整套催化过程,而腺苷也被认为是Treg细胞发挥免疫调节作用的一个重要介质。本实验的目的是观察Treg细胞保护小鼠MIRI的效应分子。方法 将C57BL/6背景的IL-10-/-小鼠与Foxp3-GFP knockin小鼠杂交得到IL-10-/-Foxp3-GFP knockin小鼠。按上述Treg细胞分离培养方法得到体外激活的IL-10-/-Treg,CD39-/-Treg和WTTreg细胞用于过继转输实验。于再灌注前5分钟分别静脉注射anti-TGF β 1抗体加WT Treg细胞,IL-10-/-Treg或CD39-/-Treg细胞,再灌注后24小时检测上述MIRI相关指标。结果 与WT Treg细胞相比,静脉注射anti-TGF β1抗体加WT Treg细胞或IL-10-/-Treg细胞有相同的保护MIRI作用,表现为梗死面积下降及心功能改善;然而CD39-/-Treg细胞对MIRI无保护作用。结论 小鼠MIRI中,体外激活的Treg细胞通过表面分子CD39而不是IL-10和TGF-β1发挥心脏保护作用。第三部分Treg细胞通过抑制心肌细胞凋亡和中性粒细胞浸润减轻MIRI目的心肌细胞凋亡及中性粒细胞浸润在小鼠MIRI进程中发挥重要作用。本实验的目的是探究在MIRI中,Treg细胞对小鼠心肌细胞的凋亡以及中性粒的细胞浸润的影响,并研究其作用机制。方法随机将C57BL/6小鼠分为四组:假手术组(Sham,只穿线不结扎),Treg细胞组(给予体外激活的WT小鼠Treg细胞,Treg),CD39-/-Treg细胞组(给予体外激活的 CD39-/-Foxp3-GFP knockin 小鼠 Treg 细胞,CD39-/-Treg),对照组(给予 PBS,Control)。再灌注后3h检测小鼠心肌细胞凋亡(TUNEL染色法),分析心肌caspase-3活性(分光光度法),髓过氧化物酶(MPO)活性和流式细胞术绝对计数检测中性粒细胞心肌组织局部的浸润情况,实时PCR和免疫印迹检测心肌局部趋化分子(LIX,KC和MIP-2)的表达。此外,C57BL/6小鼠随机分为两组:假手术组(Sham),MIRI组(按上述方法建立MIRI模型,MIRI)。分别于再灌注后30分钟,1小时和3小时western blot检测RISK信号通路的激活情况。分离乳鼠原代心肌细胞,H202刺激后不同时间点(30分钟,1小时,3小时)western blot检测Akt和ERK1/2磷酸化水平;将乳鼠原代心肌细胞分别与体外激活的WTTreg细胞、CD39-/-Treg细胞或腺苷共培养48小时,再在培养体系中加入ATP并以H202刺激,30分钟后western blot检测Akt和ERK1/2的磷酸化,4小时后TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,24小时后ELISA检测上清趋化分子KC和LIX的表达,transwell检测中性粒细胞的趋化。结果 在小鼠MIRI模型中,与介质组(Vehicle)相比,WTTreg细胞组心肌凋亡减少,中性粒细胞浸润数目下降,心肌组织局部中性粒细胞趋化分子KC和LIX表达减少。然而过继转输CD39-/-Treg细胞对心肌凋亡及中性粒细胞浸润没有明显影响。体外实验中,与对照组(Control)相比,与WTTreg细胞共培养可明显减少H2O2引起的心肌细胞凋亡及趋化分子KC和LIX表达,减少中性粒细胞的迁移。但缺乏CD39可部分阻断Treg细胞的这一保护作用。此外培养体系中加入腺苷也发挥与WT Treg细胞相同效应。再灌注后Akt和ERK1/2的磷酸化在心肌组织中明显增高,于30分钟达到高峰,3小时有所下降。与介质组(Vehicle)相比,过继转输WTTreg细胞可明显增高小鼠再灌注后30分钟心肌局部Akt和ERK1/2的磷酸化,而CD39-/-Treg细胞组则无明显差异。乳鼠原代心肌细胞经H2O2刺激后Akt和ERK1/2的磷酸化明显增高,并于30分钟到达高峰,3小时有所下降。与对照组(Control)相比,心肌细胞与WTTreg细胞共培养可明显增加Akt和ERK1/2的磷酸化,但缺乏CD39可阻断Treg细胞的这一作用,此外预先将腺苷加入培养体系也可以增加心肌细胞中Akt和ERK1/2的磷酸化。结论 活化的Treg细胞通过CD39抑制心肌细胞凋亡,激活促生存的信号通路Akt和ERK1/2,并减少中性粒细胞浸润而保护MIRI。第四部分急性心肌梗死患者急诊PCI术后外周血中Treg细胞比例下降,但CD39表达增高目的通过证实Treg细胞在小鼠MIRI模型中的保护作用,本实验的目的是观察急性ST段抬高型心肌梗死患者再灌注后体内Treg细胞的改变。方法收集15例进行急诊PCI治疗的急性ST段抬高型心肌梗死患者,分别于不同时间点(血管再通前,球囊扩张时,植入支架后1小时,6小时,12小时,24小时和72小时)采血。另收集15例年龄性别相匹配的冠脉造影证实冠脉正常的健康对照并采血。流式检测患者与健康对照外周血中Treg细胞的比例及其表面分子CD39的表达。结果与健康对照组相比,STEMI患者血管再通前外周血Treg细胞占CD4+T细胞比例无明显差异。但与血管再通前相比,患者在球囊扩张及支架植入后外周Treg细胞比例开始下降,支架植入1小时后下降有统计学意义,6小时最低,72小时后仍呈下降状态。CD39+Treg细胞占CD4+T细胞比例在患者血管再通后并没有明显改变,而CD39+细胞占Treg细胞比例在患者血管再通后增高,并在12小时及24小时有差异有统计学意义。结论STEMI患者在血管再通后外周血中Treg细胞比例下降,但Treg细胞中表面分子CD39表达增高。